Proteinstruktur for fosfolipase A hos Helicobacter pylori og bakteriens sykdomsfremkallende evne
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 2008122
- Ansvarlig person
- Geir Bukholm
- Institusjon
- Akershus universitetssykehus HF
- Prosjektkategori
- Postdoktorstipend
- Helsekategori
- Infection
- Forskningsaktivitet
- 2. Aetiology
Rapporter
Helicobacter pylori's pldA, genet som koder for fosfolipase A (OMPLA), er fasevariabelt. Vi har spekulert i om fasevariasjonen kan være assosiert med virulens. Vi har derfor studert effekten av H. pylori med og uten aktiv OMPLA på AGS celler. Microarray har blitt brukt for å kartlegge vertscelleresponsen. Forsøkene viste ikke signifikante forskjeller mellom ON og OFF varianten.
Det har blitt etablert en simulert OMPLA proteinstrukturmodell ved å sammenlikne DNA-sekvenser fra OMPLA-lignende proteiner fra ca 1000 ulike arter. For å bekrefte og justere modellen har det vært jobbet intenst på laboratoriet med å produsere aktivt OMPLA-protein. En røntgenkrystallografisk undersøkelse av proteinet ville deretter vise oss hvordan proteinstrukturen ser ut i virkeligheten. Dette arbeidet har dessverre vært mer krevende enn forventet og vi har ikke nådd målet så langt.
Vi vet ikke sikkert hvorfor pldA-genet har evnen til fasevariasjon. Men bakterien ville ikke ha beholdt dette genetiske elementet dersom det ikke var til nytte for den. Vi har funnet at OMPLA er nødvendig for at H. pylori skal overleve ved lav pH. Alle endringer i OMPLA som ødelegger fosfolipaseaktiviteten gjør at bakterien mister evnen til å overleve ved pH 3.5. Vi mistenker ut fra modellen at OMPLA kan danne en pore som er koblet til proton-transport. Kanskje har OMPLA andre oppgaver enn bare fosfolipase aktivitet.
Helicobacter pylori's forfolipase A er nødvendig for at H. pylori overlever i sitt miljø. Studien vil kunne gi økt forståelse for hva som er de viktige forutsetninger for bakteriens overlevelse og derved gi innspill til mulige strategier for å bekjempe denne bakterieinfeksjonen hos pasienter som er blitt smittet. Den vil også kunne belyse muligheter for en strategi for å hindre smitteoverføring fra et individ til et annet. Bakterien er på verdensbasis årsak til betydelig morbiditet, både i form av magesår og kreft i magesekken. Kreft i magesekken er en av de kreftformer som tar flest liv på verdensbasis. Helicobacter-assosierte sykdommer rammer personer i midlere aldersklasser. Den samfunnsmessige nytten av å kunne kontrollere denne infeksjonen er svært stor, sett i et globalt perspektiv.
Et aktivt yttermembranprotein fosfolipase A (OMPLA)er nødvendig for at H. pylori overlever ved lav pH.H. pylori er en bakterie som benytter seg av å ha et ustabilt genom for å kunne tilpasse seg til ulike miljømessige situasjoner. Vår forskningsgruppe har funnet at pldA, genet som koder for fosfolipase A (OMPLA) hos H. pylori, er fasevariabelt. Mekanismen gir bakterien en mulighet til å skru OMPLA aktiviteten PÅ eller AV. Bakterievariantene med en aktiv OMPLA karakteriseres ved at de har en cellevegg med svært høyt innhold av lysofosfolipider. Vår forskningsgruppe har vist at denne fasevariasjonen kan være assosiert med bakteriens sykdomsfremkallende evne.
For å forstå denne prosessen videre mht proteinets funksjon i forhold til sykdomsutvikling, er det nødvendig å kjenne proteinets struktur. Vi har derfor uttrykt H. pylori’s OMPLA i E. coli. OMPLA har blitt isolert som ’inclusion bodies’ og vi jobber nå med å få foldet det denaturerte proteinet korrekt - en prosess som har vist seg å være mer komplisert enn forventet. Men når vi har oppnådd et foldet, aktivt protein skal dette krystalliseres og røntgenkrystallografiske analyser vil deretter vise oss hvordan proteinstrukturen ser ut i virkeligheten.
Krystallstrukturen vil forhåpentligvis gi oss en forklaring på hvorfor OMPLA er nødvendig for at H. pylori skal overleve ved lav pH. Vi har nemlig vist at alle endringer i OMPLA som ødelegger fosfolipaseaktiviteten, både fasevariasjon og andre tilfeldige mutasjoner, gjør at bakterien mister evnen til å overleve ved pH 3.5. Vi mistenker utfra datasimuleringer at OMPLA kan danne en pore som er koblet til proton-transport.
Funnene så langt danner grunnlaget for flere publikasjoner som er under prosess.
Yttermembranproteinet fosfolipase A kan være knyttet til type-IV sekresjonssystemet som sender CagA inn i vertscellene.H. pylori er en bakterie som benytter seg av å ha et ustabilt genom for å kunne tilpasse seg til ulike miljømessige situasjoner. Vår forskningsgruppe har funnet at pldA, genet som koder for fosfolipase A (OMPLA) hos H. pylori, er fasevariabelt. Mekanismen gir bakterien en mulighet til å skru OMPLA aktiviteten PÅ eller AV. Bakterievariantene med en aktiv OMPLA karakteriseres ved at de har en cellevegg med svært høyt innhold av lysofosfolipider. Vår forskningsgruppe har vist at denne fasevariasjonen kan være assosiert med bakteriens sykdomsfremkallende evne.
For å forstå denne prosessen videre mht proteinet funksjon i forhold til sykdomsutvikling, er det nødvendig å kjenne proteinets struktur. Vi har derfor uttrykt H. pylori’s OMPLA i E. coli. OMPLA har blitt isolert som ’inclusion bodies’ og vi jobber nå med å få foldet det denaturerte proteinet korrekt. Når vi har et foldet, aktivt protein skal dette krystalliseres og røntgenkrystallografiske analyser vil deretter vise oss hvordan proteinstrukturen ser ut i virkeligheten.
Vi studerer også effekten av å utsette AGS celler for H. pylori med og uten aktiv OMPLA-protein. Det jobbes med å kartlegge ekspresjons-profiler samt vertscelle-responsen på protein-nivå. Mikromatriseforsøkene foreligger og bioinformatiske verktøy skal benyttes for å sammenligne de to gruppene undersøkt ved 5 forskjellige tidspunkter.
Vi har dessuten bragt på det rene at bakteriens effektive fosfolipase aktivitet ikke kun er bestemt av fosfolipasen selv, men også er et resultat av en interaksjon med andre bakterielle faktorer. For eksempel har det vist seg at det er en korrelasjon mellom fosfolipase-aktivitet og nærvær av genet som koder for den kjente virulensfaktoren CagA. CagA er avhengig av et type-IV sekresjonssystem for å interagere med vertscellen. Spørsmålet nå er om type-IV sekresjonssystemet på noen måte kan være koblet mot fosfolipaseaktivitet og den membranforstyrrende effekten som dette enzymet kan gi.
Funnene så langt danner grunnlaget for flere publikasjoner som er under prosess.
Simulert struktur for yttermembran fosfolipase A hos Helicobacter pylori er etablert. Dette danner grunnlag for studier av hvordan Helicobacter pylori fremkaller sykdom (kreft i magesekken og magesår). Sekvensstudiene viser at genet er konservert, men man finner et skille mellom idoeuropeiske stammer og øst-asietiske stammer.Prosjektet skal kartlegge sammenhengen mellom struktur for fosfolipase A hos Helicobacter pylori og bakteriens evne til å gi sykdom. Vi har tidligere påvist en klassisk fasevariasjon i OMPLA-genet og vist at det er en sammenheng mellom denne fasevariasjon og bakteriens virulens. Vi har derfor startet arbeidet med en proteinstrukturmodell som grunnlag for videre studier. Vi har sammenlignet DNA-sekvenser fra OMPLA-lignende proteiner fra ca 1000 ulike arter. På denne bakgrunn er det etablert en simulert proteinmodell. Denne simulerte modellen legges nå til grunn for videre studier (2 artikler i ferd med å bli ferdigstilt). Det er videre sekvensert OMPLA fra 230 Helicobacter pylori-stammer. Av disse er 20 øst-asietiske stammer. Genet er svært konservert i motsetning til Helicobactergenomet generelt. Man finner imidlertid en indo-europeisk og en østasiatisk fylogenetisk linje. Dette er analogt med andre virulensgener (1 artikkel under forberedelse). Man har også sekvensert 146 Helicobacter pylori-isolater fra "normale" kontrollpersoner (uten symptomer)og funnet at nesten alle har den aktive formen for OMPLA. Dette indikerer at den aktive OMPLA-fasevarianten er den naturlig forekommende variant både hos pasienter med ulcus-sykdom og hos "normale".
OMPLA-genet er nå klonet og plassert i ekspresjonsvektor for krystallisering. Dette gjøres i samarbeid med CMBN ved Rikshospitalet. Denne krytallstrukturen vil bli modellert videre.
Den foreløpige modellstrukturen legges til grunn for en ny virulensmodell for hvordan denne bakterien interagerer med sin vert. Modellstrukturen gir grunnlag for å danne en hypotese om nye funksjoner knyttet til dette yttermembranproteinet. Det pågår samtidige studier i laboratoriet for å validere de funn som kommer ut av modellen. Når krytallstrukturen foreligger blir validiteten av den overordnede virulensmodellen styrket.
Vitenskapelige artikler
Esbensen, Y., Vollan, H. S. and Tannæs, T. M.
A FUNCTIONAL OUTER MEMBRANE PHOSPHOLIPASE A (OMPLA) IS REQUIRED FOR SURVIVAL OF HELICOBACTER PYLORI AT PH 3.5
Helicobacter 2011, 16(S1), 97-98
Vollan, HS; Portella, G; Tannaes, T, Vriend G, Bukholm, G
A homology model of H-pylori OMPLA
HELICOBACTER Volume: 13 Issue: 5 Pages: 423-423 Published:
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til eRapport