Protection against genome instability
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 2011028
- Ansvarlig person
- Kirsten Skarstad
- Institusjon
- Oslo universitetssykehus HF
- Prosjektkategori
- Doktorgradsstipend
- Helsekategori
- Cancer
- Forskningsaktivitet
- 1. Underpinning
Rapporter
DNA replikasjon er en konservert biokjemisk prosess som i store trekk er den samme uavhengig av art. Det er dermed mulig å studere svikt i protein-protein og protein-DNA interaksjoner hos modellorganismen E. coli og få økt innsikt i hva som forårsaker genominstabilitet. I humane celler kan genominstabilitet gi kreftutvikling.
Proteinet SeqA er med på å kontrollere initiering av replikasjonen og organisering av nylig replikert DNA. I E.coli blir alle GATC-seter i DNA sekvensen metylert av enzymet Dam metylase. Like etter replikasjonen er bare den gamle tråden metylert. Før Dam metylase kommer til og metylerer den nye tråden befinner GATC-setene i en hemimetylert tilstand. SeqA proteinet binder til slike hemimetylerte GATC seter i oriC og forhindrer dermed re-initiering ved å blokkere for initieringsproteinet DnaA. SeqA sitter her i omtrent 1/3 av cellesyklusen.Samtidig binder også SeqA til andre hemimetylerte GATC seter ellers på kromosomet og ser på denne måten ut til å være med i organisering av nylig replikert DNA.
SeqA består av i alt 181 aminosyrer, har to funksjonelle domener og den minste bindingsenheten er en dimer. Den C-terminale enden binder DNA, mens den N-terminale enden har evnen til å interagere med andre SeqA dimere og multimerisere til en fiberlignende struktur som antageligvis er viktig med tanke på organisering av det nylig replikerte DNAet.
SeqA sin rolle i kontroll av initiering av replikasjon er mye studert, men man vet mindre om SeqA sin rolle i organiseringen av det nylig replikerte DNAet og om dannelsen av en SeqA multimer bak replikasjonsgaffelen er viktig for stabilisering av det nye DNAet og dermed også genomstabilitet.
I dette prosjektet har vi karakterisert SeqA-mutanter i lys av genominstabilitet, og resultatene tyder på at SeqA komplekser er involvert i stabilisering og restart av replikasjonsgafler. Dette underbygges også av funn i studien som viser at antall SeqA molekyler per replikasjonsgaffel er konstant under ulike vekstvilkår.
En komponent av replisomet (replikasjonsmaskineriet) er ß-clamp loaderen. ß-clamp loaderen laster på et ringformet protein kalt ß-clamp rundt DNAet slik at replisomet er tjoret fast til DNA templatet og kan effektivt syntetisere nytt DNA. I denne studien har vi studert en mutant av ß-clamp loaderen som ikke påvirker ß-clamp loadingen. Resultatene indikerer tydelig at ß-clamp loaderen også spiller en hittils ukjent rolle i restart av replikasjonsgafler.
Studien har resultert i to manuskripter som er klare for innsending:
Pedersen I.,Flåtten I., Fossum-Raunehaug S., Skarstad K (2016) Stabilizing SeqA structures behind Escherichia coli replication forks facilitate replication fork restart
Flåtten I., Pedersen I., Waldminghaus T.,Johnsen L., Skarstad K (2016)The Escherichia coli clamp loader has a role in the rescue of stalled replication forks
Studien har også resultert i et manuskript som skal ferdigstilles til innsending innen 2016:
Sen B., Pedersen I.,Flåtten I., Fossum-Raunehaug S., Skarstad K (2015) The amount of SeqA per replication fork remains constant over a wide range of growth rates in Escherichia coli but not in Vibrio cholera
Genominstabilitet kan gi kreftutvikling i humane celler, det er derfor viktig å kartlegge faktorer som bidrar til å sikre genomstabilitet. I denne studien har vi benyttet bakterien E.coli som modellorganisme, og studien viser at proteinene ”SeqA” og ”ß-clampen” har hittils ukjente roller innen stabilisering og restart av replikasjonsgafler. Ettersom om grunnleggende prosesser som replikasjon stort sett er konservert igjennom evolusjon vil disse funnene kunne ha betydning for forståelse av mekanismer som fører til kreftutvikling i humane celler. Grunnforskning som dette vil dermed på lengre sikt kunne bidra til å forstå hvordan genominstabilitet og forstadier til kreft kan oppstå i humane celler. Faktorer som er innvolvert i stabilisering og restart av replikasjonsgafler i humane celler benyttes også som mål for kreftbehandling. Økt forståelse for hvilke faktorer som inngår i stabilisering og restart av replikasjonsgafler vil derfor være verdigfullt med tanke på fremtidig kreftbehandling.
DNA replikasjon er en konservert biokjemisk prosess som i store trekk er den samme uavhengig av art. Det er dermed mulig å studere svikt i protein-protein og protein-DNA interaksjoner hos modellorganismen E. coli og få økt innsikt i hva som forårsaker genominstabilitet. I humane celler kan genominstabilitet gi kreftutvikling.Proteinet SeqA er med på å kontrollere initiering av replikasjonen og organisering av nylig replikert DNA. I E.coli blir alle GATC-seter i DNA sekvensen metylert av enzymet Dam metylase. Like etter replikasjonen er bare den gamle tråden metylert. Før Dam metylase kommer til og metylerer den nye tråden befinner GATC-setene i en hemimetylert tilstand. SeqA proteinet binder til slike hemimetylerte GATC seter i oriC og forhindrer dermed re-initiering ved å blokkere for initieringsproteinet DnaA. SeqA sitter her i omtrent 1/3 av cellesyklusen.Samtidig binder også SeqA til andre hemimetylerte GATC seter ellers på kromosomet og ser på denne måten ut til å være med i organisering av nylig replikert DNA.
SeqA består av i alt 181 aminosyrer, har to funksjonelle domener og den minste bindingsenheten er en dimer. Den C-terminale enden binder DNA, mens den N-terminale enden har evnen til å interagere med andre SeqA dimere og multimerisere til en fiberlignende struktur som antageligvis er viktig med tanke på organisering av det nylig replikerte DNAet.
SeqA sin rolle i kontroll av initiering av replikasjon er mye studert, men man vet mindre om SeqA sin rolle i organiseringen av det nylig replikerte DNAet og om dannelsen av en SeqA multimer bak replikasjonsgaffelen er viktig for stabilisering av det nye DNAet og dermed også genomstabilitet.
Ett tegn på genominstabilitet er opphopning av dobbeltrådbrudd noe som igjen kan gi kromosomal fragmentering. Dobbeltrådbrudd kan forekomme i normal vekst og blir normalt reparert. Puls-felt gel elektroforese (PFGE) er en metode som kan benyttes å studere graden av kromosomal fragmentering.
Ida Benedikte Pedersen er stipendiat på prosjektet og jobber parallelt med to ulike subprosjekter.
I det første prosjektet er graden av kromosomal fragmentering blitt studert hos to ulike seqA mutanter, seqA2 og seqA4, ved hjelp av PFGE. Mutanten seqA4 har en punktmutasjon i N-terminalen og dette forstyrrer interaksjonen mellom SeqA proteinene. Mutanten har altså ikke evnen til å multimerisere. Mutanten seqA2 har en mutasjon i C-terminalen som resulterer i manglende evne til å interagere med DNA. PFGE viser at begge seqA mutantene har en signifikant grad av kromosomal fragmentering. Binding av SeqA bak replikasjonsgaffelen ser derfor ut til å være viktig i forhold til genomisk stabilitet. seqA mutantene ser også ut til å ha problemer med å restarte replikasjonsgafler, vi tror derfor at SeqA binding bak replikasjonsgaffelen bidrar til stabilisering ved reparasjon og restart av replikasjonsgaffelen.
Det andre prosjektet innbefatter ”beta clampen” (dnaN) og ”clamp loaderen” (dnaX) som bidrar til at replisomet beveger seg langs DNAet og ikke dissosierer under replikasjon. I vår gruppe har ulike metoder blitt anvendt for å studere en dnaN og en dnaX mutant og foreløpige resultater tyder på at disse mutantene har problemer med elongeringen av DNA fordi det er mange replikasjonsgafler som kollapser. Ida har utført PFGE på dnaN og dnaX mutanten og dermed karakterisert graden av kromosomal fragmentering i de to mutantene. Vi ønsker nå å komme nærmere årsaken til elongeringsproblemene i de to mutantene.
DNA replikasjon er en konservert biokjemisk prosess som i store trekk er den samme uavhengig av art. Det er dermed mulig å studere svikt i protein-protein og protein-DNA interaksjoner hos modellorganismen E. coli og få økt innsikt i hva som forårsaker genominstabilitet. I humane celler kan genominstabilitet gi kreftutvikling.Proteinet SeqA er med på å kontrollere initiering av replikasjonen og organisering av nylig replikert DNA. I E.coli blir alle GATC-seter i DNA sekvensen metylert av enzymet Dam metylase. Like etter replikasjonen er bare den gamle tråden metylert. Før Dam metylase kommer til og metylerer den nye tråden befinner GATC-setene seg i en hemimetylert tilstand. SeqA proteinet binder til slike hemimetylerte GATC seter i oriC og forhindrer dermed re-initiering ved å blokkere for initieringsproteinet DnaA. SeqA sitter her i omtrent 1/3 av cellesyklusen.Samtidig binder også SeqA til andre hemimetylerte GATC seter ellers på kromosomet og ser på denne måten ut til å være med i organisering av nylig replikert DNA.
SeqA består av i alt 181 aminosyrer, har to funksjonelle domener og den minste bindingsenheten er en dimer. Den C-terminale enden binder DNA, mens den N-terminale enden har evnen til å interagere med andre SeqA dimere og multimerisere til en fiberlignende struktur.
SeqA sin rolle i kontroll av initiering av replikasjon er mye studert, men man vet mindre om SeqA sin rolle i organiseringen av det nylig replikerte DNAet og om dannelsen av en SeqA multimer bak replikasjonsgaffelen er viktig for stabilisering av det nye DNAet og dermed også genomstabilitet.
Ett tegn på genominstabilitet er opphopning av dobbeltrådbrudd noe som igjen kan gi kromosomal fragmentering. Dobbeltrådbrudd kan også forekomme i normal vekst og blir normalt reparert. Puls-felt gel elektroforese (PFGE) er en metode som kan benyttes å studere graden av kromosomal fragmentering.
Ida Benedikte Pedersen er stipendiat på prosjektet og jobber parallelt med 3 ulike subprosjekter.
I det første prosjektet vil graden av kromosomal fragmentering bli studert hos 2 ulike seqA mutanter, seqA2 og seqA4, ved hjelp av PFGE for å få økt innsikt i om SeqA proteinet har stabiliserende rolle ved replikasjonsgaffelen. Mutanten seqA4 har en punktmutasjon i N-terminalen og dette forstyrrer interaksjonen mellom SeqA proteinene. Mutanten har altså ikke evnen til å multimerisere. Mutanten seqA2 har en mutasjon i C-terminalen som resulterer i manglende evne til å interagere med DNA. Ved å sammenligne disse to mutantene håper vi å få innsikt i hvilke funksjoner ved SeqA proteinet som er viktig for dens rolle i genomstabilitet.
Det andre prosjektet innbefatter ”beta clampen” (dnaN) og ”clamp loaderen” (dnaX) som bidrar til at replisomet beveger seg langs DNAet og ikke dissosierer under replikasjon. I vår gruppe har ulike metoder blitt anvendt for å studere en dnaN og en dnaX mutant og foreløpige resultater tyder på at disse mutantene har problemer med elongeringen av DNA fordi det er mange replikasjonsgafer som kollapser. Ida skal i dette prosjektet anvende PFGE for å undersøke grad av kromosomal fragmentering i overnevnte mutanter.
I det tredje prosjektet studeres effekten av ulike fluoreserende protein på SeqA sin funksjon i cellen. Merking av SeqA med fluoreserende protein har vist seg å påvirke funksjonen til SeqA, dette har blitt vist ved flow cytometri i vår gruppe. De fluoreserende proteinene YPET og mKate resulterer i en asynkron phenotype når cellene blir undersøkt med flow cytometri, mens dette ikke er tilfellet ved bruk av det fluoreserende proteinet YFP. Vi ønsker å studere dette nærmere, blant annet ved å undersøke om det er spesifikke residuer i YFP som gjør at merkingen med dette fluoreserende proteinet er mer gunstig enn merking med YPET eller mKate.
DNA replikasjon er en konservert biokjemisk prosess som i store trekk er den samme uavhengig av art. Det er dermed mulig å studere svikt i protein-protein og protein-DNA interaksjoner hos modellorganismen E. coli og få økt innsikt i hva som forårsaker genom instabilitet. I humane celler kan genom instabilitet gi kreftutvikling.Før deling er det nødvendig for cellen å kopiere alt arvemateriale slik at hver dattercelle får den samme genetiske informasjonen. Proteinet SeqA er med på å kontrollere intiering av replikasjonen og organisering av nylig replikert DNA. Like etter replikajsonen er bare den gamle tråden metylert og vi har da hemimetylert DNA. Det er adeninen i GATC seter som metyleres av enzymet DAM metylase. Før dette enzymet kommer til og metylere den den nye tråden binder SeqA til hemimetylerte GATC seter i oriC og forhindrer dermed re-initiering ved å blokkere for DnaA. SeqA sitter her i 1/3 av cellesyklusen. Samtidig binder også seqA til andre hemimetylerte GATC seter uteover oriC og ser på denne måten ut til å være med i organisering av nylig replikert DNA.
SeqA består av i alt 181 aminosyrer med to funksjonelle domener, C-terminalen binder DNA, mens N-terminalen har evnen til å interagere med andre SeqA dimere og multimerisere til en fiberlignende struktur som en tror er viktig med tanke på organisering av det nylig replikerte DNAet. Mutering i N-terminalen gir manglende evne til å multimerisere. I mutanten seqA4 har aminosyre 25 blitt byttet fra en alanine til en threonine og dette forstyrrer interaksjonen. Mutanten har altså ikke evnen til å multimerisere. Proteinet SeqA binder altså bak replikeringsmaskineriet kalt replisomet. Det har tidligere blitt observert at SeqA er co-lokalisert ved nysyntetisert DNA. Gruppen vår har imidlertid funnet at avstanden mellom replisomet og SeqA er i gjennomsnitt er ca 250-300nm. Replisomet og SeqA var da merket med to ulike fluoreserende protein.
Ida Benedikte Pedersen er stipendiat på prosjektet og jobber parallelt med 2 ulike subprosjekt. Det ene går ut på å sette opp en genomisk screen og med dette prøve å detektere bindingspartnere til proteinet SeqA, mens vi i det andre prosjektet tar sikte på å undersøke kromosomal fragmentering i seqA mutanter.
Mutanten ?seqA ?recA dukket opp i en screen i litteraturen. Denne dobble mutanten viste seg å ikke være levedyktig ved 30 °C. På bakgrunn av dette ble seqA4 mutanten som har en punktmutasjon i N-terminalen og derfor ikke klarer å multimerisere kombinert med en recA delesjon og dermed svekket på to fronten. Dette gav følgende phenotype: død ved 30 ° C og levedyktig ved 42 °C. I litteraturen har det blitt foreslått at SeqA kan tenkes å å interagere med membrankomponenter, det er også foreslått at SeqA interagerer med Topoisomerase IV som bl.a. relakserer DNA under replikasjonen. Vi har laget et plasmid-bibliotek som er innført i celler av den dobble mutanten og så screener vi ved 30 °C . Plasmid som får stammen til å overleve ved denne temperaturen kan da inneholde et DNA insert som koder for en eventuell bindingspartner.
Det andre prosjektet går ut på å undersøke om det skjer kromosomal fragmentering i ulike seqA mutanter. Metoden som brukes til dette er pulsed field gel elektroforese. P1 transduksjon benyttes til å konstruere de stammene som skal undersøkes.
Opphopning av dobbeltråd brudd kan gi kromosomal fragementering. Dobbeltrådbrudd kan forekomme i vekst og blir normalt reparert. Årsaken til dobbeltrådbrudd kan være overinitiering som fører til for mange gafler som så kollapser, det kan også være grunnet et nick i en av DNA trådene som ikke blir reparert før replikasjonsgaffelen når frem. Den ene tråden som blir replikert vil da ikke lenger være tilkoblet og derfor utgjøre et fragment.
Instability of genomes is an underlying cause in the development of cancer. In the present project we are investigating how the protein SeqA is able to prevent genome fragmentation. The goal of the project is to find the underlying protein-protein and protein-DNA interactions that enable the SeqA protein to prevent chromosome fragmentation.PhD student Ida Benedikte Pedersen started working on the project July 1st 2011. She has made very good progress along two lines of investigation (see below). Since only seven months have passed since she started there are no publications directly from her hand. We list below the publication from the group which is relevant to the project.
1. A library of DNA fragments covering the E. coli genome have been constructed and will be used in a screen to find proteins that interact with the SeqA protein.
2. Cells that lose the function of SeqA exhibit extensive chromosome fragmentation. This can be detected by pulse field gel electrophoresis (PFGE) of chromosomes from cells which in addition have a deficiency in recombination repair. It is important to investigate the fragmentation in the absence of repair in order to get a correct estimate of the magnitude of the fragmentation. The cause of chromosome fragmentation is double strand breaks. The double strand breaks can in principle arise from three different types of events: i) damage causing simultaneous breakage of both DNA strands, ii) damage causing a breakage of one strand in front of the replication fork which is not repaired by the time the fork reaches the site, and iii) stalling of replication forks with the next fork running into it from behind (so called rear-ending). It has been thought that the cause of fragmentation in the case of cells without SeqA function was by rear-ending of replication forks (because these cells have lost sequestration). Without sequestration, extra rounds of replication will be allowed and are in fact initiated in excess because extra initiation potential is present in the cells due to lack of sequestration of the initiator gene promoter causing subsequent over-initiation due to overexpression of initiator protein.
Our preliminary experiments indicate that the seqA4 mutant has a more severe effect on genome stability compared to the seqA2 mutant. We have chosen to study cells with these two mutations because they each affect very different aspects of the protein’s function. The SeqA protein has two distinct domains (N-terminal and C-terminal) which are separated by a linker peptide. The N-terminal domain is the multimerization domain. The SeqA4 protein harbours a changed amino acid in this domain and cannot form multimers. The SeqA2 protein can form multimers because the N-terminal domain is normal, but cannot interact with DNA because of a changed amino acid in the C-terminal DNA binding domain.
Analysis of the two mutants by flow cytometry indicate that seqA4 mutant cells but not seqA2 mutant cells experience severe genome instability. Experiments with PFGE are underway.
Publications:
Waldminghaus T, Weigel C and Skarstad K (2012) Replication fork movement and methylation govern SeqA binding to the Escherichia coli chromosome (Nucleic Acids Research, in press)
Vitenskapelige artikler
Waldminghaus Torsten, Weigel Christoph, Skarstad Kirsten
Replication fork movement and methylation govern SeqA binding to the Escherichia coli chromosome.
Nucleic Acids Res 2012 Jul;40(12):5465-76. Epub 2012 feb 28
PMID: 22373925
Doktorgrader
Ida Benedikte Pedersen
Factors that affect the stability and restart of replication forks in Echerichia coli
- Disputert:
- november 2015
- Hovedveileder:
- Kirsten Jane Skarstad
Deltagere
- Ida Benedikte Pedersen Doktorgradsstipendiat
- Kirsten Jane Skarstad Hovedveileder
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til eRapport