Amino acids in retinal neuronal signaling and pathology
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 2015026
- Ansvarlig person
- Torstein Lyberg
- Institusjon
- Oslo universitetssykehus HF
- Prosjektkategori
- Postdoktorstipend
- Helsekategori
- Eye, Metabolic and Endocrine, Neurological
- Forskningsaktivitet
- 2. Aetiology, 5. Treatment Developement
Rapporter
Glutamin er essensiell for normale synsfunksjoner. Vi har identifisert en familie av glutamintransportører (Solute carrier family 38 (Slc38)) som transporterer glutamin gjennom cellemembraner og regulerer intra- og ekstracellulære glutaminkonsentrasjoner. En forståelse av netthinnens patofysiologi krever innsikt i mekanismer involvert i glutaminets cellulære opptak, metabolisme og dets bidrag til signalstoffdannelse. Slik kunnskap kan bidra til utvikling av ny behandling, diagnostikk og iverksettelse av preventive tiltak.
Utgangspunktet for dette prosjektet var 3 hypoteser:
1) at glutaminets cellulære transport og metabolisme i retina styres av de samme mekanismene som i resten av sentralnervesystemet. Dvs at Slc38 transportører frakter glutamin fra Müller celler til nerveceller for syntese av signalstoffene glutamat og GABA.
2) at funksjonsfeil i glutamintransportører kan være årsak til flere øyesykdommer, som retinal degenerasjon.
3) at regulering av glutamintransportører kan anvendes terapeutisk.
Vi har i prosjektperioden lyktes å gjøre flere svært viktige funn:
A) Vi har undersøkt to brødre som utviklet synsvekkelse, epilepsi og kognitiv retardasjon fra ca. ett års alder, klinisk forenlig med progressiv myoklon epilepsi og nevronal ceroid lipofuscinose. Cerebrospinalvæsken viste økt glutamin- og redusert glutamatnivåer. Ved gensekvensering identifiserte vi en mutasjon i Potassium Channel Tetramerization Domain 7 (KCTD7). Dernest viste vi at KCTD7 er en K+-kanal på plasmamembraner og som hyperpolariserer og stabiliserer nerveceller. Sykdomsassosierte KCTD7-genvarianter hemmer K+-kanalen og fører til ukontrollert nervecellefyring. KCTD7 regulerer også aktiviteten til Slc38a2 som akkumulerer glutamin i glutamaterge nerveceller for glutamatsyntese. De patologiske KCTD7-genvariantene hemmer Slc38a2 og dette resulterte i de påviste høye glutamin- og lave glutamatnivåer i CSF. Dette arbeidet ble publisert i det velrenommerte tidsskriftet Brain (Moen et al., 2016) fikk pris for fremragende artikkel ved OUS.
B) Glaukom er kjennetegnet ved degenerasjon av retinale ganglieceller og forhøyet intraokulært trykk og som kan føre til blindhet. En del pasienter har nomalt trykk (NTG) noe som antyder at andre faktorer kan være involvert. Vi utsatte i perioder glaukompasienter og kontrollpersoner med normobar hypoksi og blodprøver ble tatt før, under og etter en slik intervensjon. NTG-pasienter hadde signifikant lavere aminosyre- og laktatkonsentrasjoner i utgangspunktet. Ved hypoksi steg laktatverdiene men ikke aminosyre eller glukoseverdier. Dette styrker hypotesen om at glaukom er en systemisk sykdom med retinal manifestasjon. Dessuten viser studien vår at laktat og total aminosyrer er potensielle markører for NTG (Vohra et al., Acta Ophtalmologica, 2019).
C) Vi har nå vist at Slc38a3 og Slc38a5 frigjør glutamin fra Müller celler som bidrar til signalstoffdannelse i fotoreseptorer og nerveceller. Vi viser også at ved leversvikt akkumuleres ammonium i retina og hemmer Slc38. Glutamin blir da ikke frigjort fra Müller celler, men akkumulerer i Müller celler og fører til ødemdannelse. Ammonium hemmer også en Slc38 transportør i GABAerge nerveceller. Dermed blir det en ubalanse mellom GABAerg og glutamaterg signalering. Det fører til eksotoksisitet og nervecelletap og er grunnlaget for hepatisk retinopati (Hamdani et al., tentativ submission februar 2019).
D) En ny aminosyretransportør er også karakterisert ihht hovedmålene. Den er anriket i stamceller og kobler aminosyretransporten med ioneflukser gjennom proteinet og stimulerer stamcelleproliferasjon. Den er derfor viktig for utvikling og vedlikehold av celler i CNS og retina (MS in preparation).
E) Vi har testet om flere aminosyreanaloger kan hemme glutamintransportører. Dessverre har de lav affinitet med potensielt mange bivirkninger og er derfor lite egnet for terapeutisk anvendelse. Vi vil i fremtiden teste om andre analoger er mer egnet for regulering av Slc38 transportører.
Vi har demonstrert betydning av en familie av glutamintransportører (Slc38) og/eller aminosyrer for tre øyesykdommer, nemlig progressiv myoklon epilepsi, glaukom og hepatisk retinopati og vi har avslørt patofysiologiske mekanismer som er involvert. Vi har også tested aminosyreanaloger som kan regulere transportøraktiviteten og vurdert om de kan anvendes terapeutisk mot disse sykdommene. Prosjektet har derfor på lang sikt stort potensial i behandling av øye- og nervesykdommer.
NEI
Aminosyrene glutamat og GABA er de viktigste henholdsvis eksitatoriske og inhibitoriske signalstoff i hjernen. De antas å bli syntetisert fra glutamin - også en aminosyre. Vi studerer hvordan glutamin tilgjengelighet, celleopptak og metabolisme bidrar til nervecellesignalering og eventuelt utvikling av hjerne- og øyesykdommer.Glutamin antas å være utgangsstoff for signalstoff men bidrar dessuten til f.eks. cellenes energistatus, pH regulering og antioksidant forsvar. Vi tror inadekvat tilførsel eller metabolisme av glutamin fører til utvikling av hjerne- og netthinnesykdommer, slik som epilepsi, demens og fotoreseptor-degenerasjon.
Vi har molekylært karakterisert en familie av transportører som transporterer glutamin gjennom cellemembranen: SN1 og SN2 er lokalisert på astrogliamembraner og frigjør glutamin som transporteres av SAT1 og SAT2 inn i henholdsvis GABAerge og glutamaterge nerveceller. Målet for dette prosjektet er å demonstrere (pato-)fysiologiske mekanismer involvert i glutaminets cellulære transport og metabolisme, og anvende dette terapeutisk.
Prosjektets tre hovedmål:
1. Generering av mus genetisk inaktivert for SN1 spesifikt i Müller celler i relasjon til synspatologi er forsinket pga tekniske problemer. Vi har derfor i stedet intensivt undersøkt to brødre som ble født normale men som utviklet synsvekkelse, epilepsi, gangforstyrrelser og kognitiv retardasjon fra ca. ett års alder (Moen et al., Brain, 2016). Cerebrospinalvæsken (CSF) inneholdt økte glutamin- og reduserte glutamatnivåer. Klinisk er denne sykehistorien forenlig med progressiv myoklon epilepsi, en behandlingsrefraktær dødelig tilstand med ukjent etiologi. Ved gensekvensering oppdaget vi at disse brødrene har en mutasjon i Potassium Channel Tetramerization Domain 7 (KCTD7), et protein med ukjent funksjon. Vi avslører nå at KCTD7 uttrykkes på nervecellemembraner og er en ny type K+-kanal som hyperpolariserer og stabiliserer nerveceller. De sykdomsassosierte KCTD7-genvarianter viser hemning av K+-kanalen og fører til ukontrollert nervecellefyring. KCTD7 regulerer også aktiviteten til SAT2 som akkumulerer glutamin i nerveceller for glutamatsyntese. De sykdomsfremkallende genvariantene hemmer aktiviteten til SAT2, og er årsaken til de høye glutamin- og lave glutamatnivåer i CSF.
2. Vi har karakterisert en ny aminosyretransportør ihht hovedmålene. Den er anriket i stamceller og transporterer spesielt glutamin og glysin (tentativ submission: april 2018). Transportøren kobler aminosyretransporten til ioneflukser gjennom proteinet som depolariserer stamcellene og stimulerer proliferasjon av stamceller. Den nye transportøren er derfor viktig både for cellens stoffskifte, signalstoffdannelse og for nydannelse av nerveceller.
3. Vi har testet om flere glutamat- og glutaminanaloger kan hemme glutamintransportører. Dessverre har de lav affinitet med potensielt mange bivirkninger og er derfor lite terapeutisk anvendelig. Vi har derimot fått gjennombrudd på studier av et endogent toksin: hyperammoniakk fører til utvikling av leverencefalopati og -retinopati. I akuttfasen sees økt aktivitet i glutamaterge nerveceller. Senere er det typisk generelt redusert nervecellesignalering. Tilstanden kan utvikle seg til koma og eventuelt død. Vi viser at leversvikt øker ammoniakk som akkumuleres i hjernen og retina. Her interagerer ammoniumioner med glutamintransportører og regulerer deres aktivitet (Hamdani et al., tentativ submission i mars -18). Dette gir akkumulering av glutamin i astroglia- og Müller celler, noe som fører til dødelig ødemdannelse. I tillegg svekkes nervecellesignalering. Vi mener dette er den sentrale mekanismen for utvikling av leverencefalopati og retinopati.
Nei
Aminosyrer generelt, og glutamin spesielt, er viktig for normale retinale funksjoner. Vi viser nå at glutamintransport over cellemembraner kan reguleres. Det kan føre ukontrollerte nervecelleutladninger og nervedegenerasjon. Vårt arbeid viser at dette kan gi synstap og er hovedmekanismen bak utviklingen av progressiv myoklon epilepsi.Når lyset fra et objekt treffer øyets fotoreseptorer initierer det en kaskade av signaler mellom netthinnens celler, som dernest ledes til synsbarken slik at vi ser objektet. Aminosyrene glutamat, GABA og glysin er essensielle signalstoffer i netthinnens funksjon, mens glutamin er en viktig forløper for disse og bidrar dessuten til f.eks. cellenes energistatus, pH regulering og antioksidant forsvar. Glutamintransport inn i netthinnes celler og dens metabolisme bidrar til en rekke cellulære prosesser og er derfor helt essensiell for normal netthinnefunksjon. Ved for stor eller for liten tilførsel av glutamin eller forstyrrelser i cellulær stoffskifte bidrar det til utvikling av netthinnepatologier slik som fotoreseptor-degenerasjon, glaukom, ischemisk skade og diabetisk retinopati.
Vi har identifisert en familie av glutamintransportører, det vil si proteiner som har evne til å transportere glutamin over cellemembraner (enten inn eller ut). Vi har vist at nerveceller og astrogliaceller uttrykker forskjellige isoformer av slike glutamintransportører som tillater frigjøring av glutamin fra Müller- og astrogliaceller og dernest opptak i nerveceller. En av disse, SAT2 (Slc38a2), uttrykkes primært i nerveceller som bruker glutamat som signalstoff. Den akkumulerer glutamin for syntese av signalstoffet glutamat.
Vi har undersøkt en gutt med progredierende synstap. Etter normal fødsel og utvikling fram til 9 måneders alder, begynte han å få rykninger og ustødig gange etterfulgt av epileptiske anfall, svekkede motoriske ferdigheter og psykisk utviklingshemming. Han mistet gangfunksjon og taleevnen og synet ble redusert. Spinalpunksjon avslørte stigning i glutamin og signifikant reduksjon av glutamat. Behandling med forskjellige kombinasjoner av anti-epileptika var forgjeves. Seks år gammel døde han i status epileptikus. Hans yngre bror har en foreløpig lik sykdomsutvikling.
Ved eksomsekvensering har vi påvist en ny homozygot mutasjon som fører til et skifte i leserammen av genet KCTD7 (Potassium Channel Tetramerization Domain 7). Dette genet koder for et protein med hittil ukjent funksjon. Vi viser at villtype (normal) KCTD7 finnes i nervecellemembraner hvor det fungerer som en K+ kanal og og øker membranpotensialet i nerveceller. Proteinet regulerer også aktiviteten av SAT2. Videre undersøkelse av brødrenes mutasjon samt 4 andre kjente sykdomsfremkallende KCTD7-mutasjoner avslører at disse fører til dannelse av intracellulære aggregater og opphevet K+-fluks over cellemembranen. Dermed depolariseres nervecellene og blir mer tilbøyelige til ukontrollerte elektriske utladninger som fører til nervecelletap og retinadegenerasjon. Mutasjonene hemmer også SAT2 slik at det dannes mindre glutamat. Dette forstyrrer nervecellesignalering som gir svekkede hjernefunksjoner og synstap.
Klinikken hos brødrene sammenfaller med progressiv myoklonus epilepsi (PME) som kjennetegnes ved kortvarige ufrivillige rykk og generaliserte krampeanfall. Den debuterer typisk i de første barneårene og er assosiert med progredierende forfall av nevrologiske funksjoner, slik som kognitiv svikt, cerebellare ataksier og synstap. Vårt studium er det første arbeidet som kartlegger patofysiologien til KCTD7-assosiert PME og funnene gir en ny forståelse av hvorfor denne formen har et så alvorlig forløp og er så behandlingsrefraktær.
Aminosyrer generelt, og glutamin spesielt, er viktig for normale retinale funksjoner. Vi viser nå at NH4+ hemmer glutamintransport over cellemembraner. Det kan føre til opphopning av toksiske mengder av glutamin og NH4+ i retinale celler og kan forklare mekanismen for hepatisk retinopati.Når lyset fra et objekt treffer øyets fotoreseptorer initierer det en kaskade av signaler mellom netthinnens celler, som dernest ledes til synsbarken slik at vi ser objektet. Aminosyrene glutamat, GABA og glysin er essensielle signalstoffer i netthinnens funksjon, mens glutamin er en viktig forløper for disse og bidrar dessuten til cellenes energistatus, pH regulering og antioksidant forsvar. Glutamintransport inn i netthinnes celler og dens metabolisme bidrar til en rekke cellulære prosesser og er derfor helt essensiell for normal netthinnefunksjon. Ved for stor eller for liten tilførsel av glutamin, ved endringer i glutamintransport over cellemembraner eller forstyrrelser i cellulær stoffskifte bidrar det til utvikling av netthinnepatologier slik som fotoreseptor-degenerasjon, glaukom, ischemisk skade og diabetisk retinopati. Hepatisk encefalopati er en nevrologisk sykdom som skyldes akutt eller kronisk leverskade slik at NH4+ ikke detoksifiseres i lever men hoper seg opp i hjernen og retina og gir mentale forstyrrelser og koma i alvorlige tilfeller, og/eller hepatisk retinopati. Astrogliaceller og Müller celler i retina uttrykker glutamin syntetase og kan binde NH4+ til glutamat og danne glutamin som transporteres ut av retina. Dermed elimineres den toksiske effekten av NH4+.
Vi har identifisert en familie av glutamintransportører, det vil si proteiner som har evne til å transportere glutamin over cellemembraner. Vi har vist at nerveceller og astrogliaceller uttrykker forskjellige isoformer selektivt som tillater frigjøring av glutamin fra astrogliaceller og dernest opptak i nerveceller. Vi har nå avdekket at økende konsentrasjoner av NH4+ regulerer aktiviteten av flere slike glutamintransportører, slik at glutamin akkumuleres i astroglia og Müller celler. Dermed stoppes detoksifisering av NH4+. Dette skader Müller celler og omkringliggende celler og kan gi retinopati.
Manuskript med resultater på regulering av to glutamintransportører som uttrykkes i astroglia- og Müller celler gjøres klar for innsending. Vi har i tillegg utvidet denne studien og begynt å studere regulering av glutamintransportører som uttrykkes i nevroner og hvilken betydning det har for syntese av signalstoffer i hjernen og retina.
Vitenskapelige artikler
Moen MN, Fjær R, Hamdani EH, Laerdahl JK, Menchini RJ, Vigeland MD, Sheng Y, Undlien DE, Hassel B, Salih MA, El Khashab HY, Selmer KK, Chaudhry FA
Pathogenic variants in KCTD7 perturb neuronal K+ fluxes and glutamine transport.
Brain 2016 Dec;139(Pt 12):3109-3120. Epub 2016 okt 14
PMID: 27742667
Deltagere
- Dong Feng Chen Prosjektdeltaker
- Bjørnar Hassel Prosjektdeltaker
- El Hassan Hamdani Postdoktorstipendiat (finansiert av denne bevilgning)
- Marivi Nabong Moen Medveileder
- Tor Paaske Utheim Prosjektdeltaker
- Farrukh Abbas Chaudhry Hovedveileder
- Torstein Lyberg Prosjektleder
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til eRapport