Sluttføring av ph.d.-prosjekter
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 46031400
- Ansvarlig person
- Vivi Anita Talstad
- Institusjon
- NTNU, IKM
- Prosjektkategori
- ekstrautlysning 2009
- Helsekategori
- Cancer
- Forskningsaktivitet
- 1. Underpinning
Rapporter
Skader i arvematerialet kan gi opphav til kreft og reparasjon av DNA skader er derfor avgjørende for alle organismer. Vi har i dette prosjektet karakterisert funksjonen til humane varianter av reparasjons-proteinet AlkB.Kjemiske stoffer som finnes i miljøet vi lever i og inne i cellene våre kan reagere med DNA og skade det slik at det ikke kan kopieres eller kode for funksjonelle proteiner. Proteinet AlkB fra E.coli er involvert i beskyttelse mot stoffer som alkylerer og skader nukleotider i cellene våre. Til nå har ni humane varianter av AlkB blitt identifisert; ABH1-8 og FTO. Prosjektet har omfattet karakterisering av tre humane AlkB varianter med hensyn på struktur, mekanismer for substrat spesifisitet og katalyse, lokalisering, vevsuttrykk og biologiske funksjoner.
Vi karakteriserte mus og museceller som mangler disse enzymene og fant at ABH2 er hovedansvarlig for reparasjon av 1-metyladenin og 3-metylcytosin i DNA. Mus som manglet ABH2 akkumulerte 1-metyladenin i lever. Mus uten ABH3 reparerte disse skadene likt som normale mus, noe som tyder på at ABH3 har en annen biologisk funksjon enn reparasjon av DNA. ABH1 er den humane varianten som er mest lik AlkB, men likevel har karakteriseringen av proteinet vært mangelfull. Vi fant at ABH1 bruker kofaktorene jern og 2-oksoglutarat for å demetylere 3-metylcytosin i enkelttrådet DNA og i RNA. Uttrykket av ABH1 er høyest i hjerte og muskulatur, men vi fant uttrykk av ABH1 i alle vevene vi undersøkte. ABH1 er lokalisert både i mitokondrien og i cellekjernen.
Videre løste vi den tredimensjonale strukturen av humant ABH3 ved hjelp av proteinkrystallografi. Vi krystalliserte det katalytiske domenet av ABH3 sammen med kofaktorene jern og 2-oksoglutarat. Strukturen viste at ABH3 hører til dioxygenase-familien og ved hjelp av mutagenese kartla vi residuer som er involvert i katalyse. Vi identifiserte også et fleksibelt ”beta-hairpin” motiv, plassert over det aktive setet, som kan være involvert i å flippe en skadd base ut fra DNA helixen for å gjøre den tilgjengelig for reparasjon. Den siste delen av arbeidet omfatter en biokjemisk og funksjonell karakterisering av ABH2 og ABH3 der vi undersøker mekanismer som bestemmer substrat spesifisitet i disse enzymene. Vi så spesielt på det fleksible ”beta-hairpin” motivet som ble identifisert i den foregående studien. Ved hjelp av mutagenese fjernet vi dette motivet og fant at det er nødvendig for binding av DNA substrat. Ved bytting av motivet mellom proteinene fant vi at det også i stor grad bestemmer substrat spesifisitet. Vi undersøkte også mekanismen for base-flipping og identifiserte et nettverk av aminosyrer som er nødvendig for normal aktivitet av ABH2.
Formålet med prosjektet har vært å bidra til å forstå mekanismer for reparasjon av metylskader og kartlegge rollene til ABH1, ABH2 og ABH3. Talstad leverte sin avhandling i januar 2010.
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til Helse Midt-Norge RHF - Samarbeidsorganet og FFU