Diagnosing children’s airway infections: a new molecular approach
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 46084600
- Ansvarlig person
- Svein Arne Nordbø
- Institusjon
- NTNU, IKOM
- Prosjektkategori
- Korttidsprosjekt 2015
- Helsekategori
- Infection
- Forskningsaktivitet
- 4. Detection and Diagnosis
Rapporter
Det er gjort en betydelig innsats for å utvikle en molekylær test for påvisning av aktiv replikasjon av parechovirus som er vanskelig å dyrke i cellekultur og som ofte finnes i luftveissekret fra barn med luftveisinfeksjoner. Denne gruppen virus finnes ofte sammen med andre luftveisvirus og potensielt patogene bakterier, og betydningen av funnene kan være vanskelig å relatere til klinikk. Påvisning av aktiv virusreplikasjon kan derfor være en viktig markør for klinisk relevans.
Parechovirus er et såkalt enkelt-trådet "positiv strand" RNA virus som i seg selv er konstruert som et mRNA molekyl, og som kan translateres direkte på ribosomalt nivå til å danne nye virusproteiner. Påvisning av mRNA kan derfor ikke benyttes for å påvise aktiv replikasjon av parechovirus. For å produsere nytt virus-RNA blir det dannet "negativ strand" RNA som templat for nytt "positiv strand" RNA som inkorporeres i nye viruspartikler. Det er publisert noen få artikler om metoder for påvisning av "negativ strand" RNA for andre "positiv strand" RNA-virus som for eksempel Denguevirus, men ikke for parechovirus. Problemet har vært å konstruere sensitive og ikke minst spesifikke nok metoder for å påvise "negativ strand" RNA i de aktuelle prøvene. Så langt har vi ikke lyktes å utvikle en god nok metode, men det jobbes videre med dette i et pågående PhD-prosjekt.
I tillegg arbeides det også med en mRNA-metode for adenovirus, som er et DNA-virus som kan gi alvorlige luftveisinfeksjoner, men som også kan opptre tilfeldig sammen med andre luftveisvirus.
Metodeutviklingen har dessverre ikke kommet så lang at den kan benyttes i klinisk rettet diagnostikk.
I moderne diagnostikk av luftveisinfeksjoner brukes meget sensitive molekylære metoder som PCR. Dette medfører at DNA eller RNA fra mikrober kan være til stede i prøvemateriale i opptil flere uker etter at mikroben er død. Vårt mål er å utvikle raske molekylære metoder for påvisning av aktiv virusreplikasjon som erstatning for virus dyrkning.Vi kartlegger årsakene til barns luftveisinfeksjoner (LVI), for å bedre muligheten til å diagnostisere og behandle LVI, som er den viktigste årsak til mortalitet og sykdom hos småbarn. I en stor kohort av innlagte barn(n=3400) har vi funnet ett eller flere virus i sekret fra luftveiene hos 4/5 barn med LVI. Overraskende nok har 2/3 av kontrollene (n=550) også minst ett virus. Disse virus er påvist med nukleinsyre (RNA/DNA) baserte PCR-tester. Det er lagret prøver fra over 4000 barn som har vært rekruttert til Luftveisprosjektet som er et samarbeid mellom BUK (Barne- og ungdomsklinikken) og AMM (Avd. for medisinsk mikrobiologi) siden 2007. Alle prøver testes med semikvantitativ real-time PCR for 18 agens samt virus dyrkning og aerob dyrkning av bakterier. Utfordringen er at virale nukleinsyrer kan påvises i flere uker etter en aktuell luftveisinfeksjon, og at man ofte kan påvise potensielle patogene luftveisvirus hos friske pasienter. Siden virus dyrkning er tid- og ressurskrevende og ikke alle aktuelle virus kan dyrkes, vil det være nyttig å kunne påvise spesifikt mRNA som er en markør for aktiv virusreplikasjon og som forsvinner få dager etter at virusreplikasjonen opphører. Målsettingen er derfor å utvikle mRNA-tester for enkelte virus til diagnostisk bruk. Erfaringene med etablering av mRNA test for humant bocavirus har så langt vært meget lovende. I et videre perspektiv kan økt kunnskap om årsakene til barns LVI føre til bedre forebygging og behandling ved å utvikle vaksiner og antivirale midler.
Påvisning av viralt mRNA vil være et fremskritt i praktisk klinisk diagnostikk av luftveisinfeksjoner, spesielt i de tilfellene hvor man detekterer flere agens samtidig. PCR-tester som brukes i dag er meget sensitive, men en positiv test for et virus betyr ikke nødvendigvis at det er årsaken til infeksjonen. De mRNA baserte PCR-testene vil være betydelig mer spesifikke for påvisning av en aktuell infeksjon og lette tolkningen av resultatet for klinikeren. Det er både en økonomisk og en økologisk fordel, idet antibiotikabehandling kan være kostbar og føre til resistensutvikling hos bakterier.
Vårt hovedfokus i dette prosjektet har vært å etablere en molekylær metode for påvisning av en aktiv parechovirusinfeksjon hos barn med luftveisinfeksjon. Dette er en gruppe virus som relativt ofte forekommer sammen med andre luftveisvirus, også hos friske personer, og hvis betydning er delvis ukjent. Siden parechovirus er et såkalt positive strand virus som i seg selv fungerer som mRNA, har man måttet velge en annen strategi med påvisning av negative strand RNA som en markør på aktiv virusreplikasjon. Dette har medført flere tekniske og metodologiske utfordringer som har ført til at prosjektet er blitt forlenget med 7 måneder.
Molekylære metoder som PCR er i utstrakt bruk for å påvise luftveisagens hos barn med luftveisinfeksjoner. Man kan ofte påvise DNA eller RNA fra flere agens i samme prøve i opptil flere uker, og noen virus er vanskelig eller umulig å dyrke. Vårt mål er å lage tester som kan påvise en aktiv infeksjon som vi tidligere har gjort med bocavirus mRNA PCRI en stor gruppe innlagte barn (n=3400) har vi funnet ett eller flere virus i sekret fra luftveiene hos 4/5 barn med luftveisinfeksjoner (LVI). Overraskende nok har vi funnet at luftveisprøvene fra 2/3 av kontrollene (n=550) også inneholder minst ett virus. Disse virus er påvist med nukleinsyre (RNA/DNA)-baserte PCR-tester.
Det er lagret prøver fra over 4000 barn som har vært rekruttert til "Luftveisprosjektet" som er et samarbeid mellom Barneklinikken og Avd. for medisinsk mikrobiologi ved St. Olavs Hospital siden 2007. Alle prøver testes med semikvantitativ real-time PCR for 18 agens samt virus dyrkning og aerob dyrkning av bakterier. PCR-tester som brukes i dag er meget sensitive, men en positiv test for et virus betyr ikke nødvendigvis at dette er årsaken til infeksjonen. Utfordringen er at virale nukleinsyrer kan påvises i flere uker ette en aktuell luftveisinfeksjon, og at man ofte kan påvise potensielle patogene luftveisvirus hos friske pasienter. Siden ikke alle aktuelle virus kan dyrkes, vil det være nyttig å kunne påvise spesifikke markører for aktiv virusinfeksjon som forsvinner få dager etter at virusformeringen opphører. Målsettingen er derfor å utvikle mRNA-tester eller tilsvarende molekylære markører for aktiv virusinfeksjon til diagnostisk bruk. Erfaringene med etablering av mRNA test for humant bocavirus har så langt vært meget lovende. I et videre perspektiv kan økt kunnskap om årsakene til barns LVI føre til bedre forebygging og behandling ved å utvikle vaksiner og antivirale midler.
Delmål vil være å undersøke forekomst og en rekke virologiske faktorer (viremi, viruskonsentrasjon m.fl.) av såkalte Gruppe 2 virus (humant bocavirus, humant parechovirus, rhinovirus, enterovirus, adenovirus, coronavirus) som forekommer hyppig både hos luftveissyke barn og kontroller. I første omgang vil det være aktuelt å utvikle molekylære tester som er gode markører for en aktuell virusinfeksjon med parechovirus og coronavirus . Senere kan det være aktuelt å utvikle liknende tester for andre luftveisagens. Bruken av slike tester anvendt i pasientdiagnostikken kan være fordelaktig for å redusere bruken av antibiotika som kan være resistensdrivende hos bakterier.
For å få et stort nok materiale med positive prøver for enkelte agens som ikke opptrer så hyppig, vil det det være viktig å fortsette innsamlingen av luftveisprøver fra barn med LVI, samt analysere prøvene for flere faktorer. Mye ressurser vil derfor medgå til dette arbeidet i tillegg til utvikling av nye tester. En PhD-student skal arbeide med parechovirus og vil bli involvert i dette arbeidet. Det samme gjelder for en forskerlinjestudent som studerer coronavirus-infeksjoner hos barn. Begge disse virusgruppene kan påvises både hos pasienter og i kontrollgruppen og er vanskelig å dyrke, og den patogene betydningen av slike funn er usikker. Det er derfor viktig å utvikle nye tester som sammen med andre markører og kliniske funn kan være til hjelp for å gi en korrekt diagnose. Dette arbeidet vil ta tid, og det kan derfor ikke forventes noen publikasjon av resultatene i løpet av inneværende år.
Deltagere
- Andreas Christensen Prosjektdeltaker
- Kari Ravndal Risnes Prosjektdeltaker
- Henrik Døllner Prosjektdeltaker
- Svein Arne Nordbø Prosjektleder
- Lars Høsøien Skanke Doktorgradsstipendiat
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til Helse Midt-Norge RHF - Samarbeidsorganet og FFU