Betydning av de ulike promotorer samt promotor-polymorfismer for ekspresjon av ulike splice-varianter og hemning / stimulering av nedstrømsgener for MDM2
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 911535
- Ansvarlig person
- Liv Beathe Gansmo
- Institusjon
- Helse Bergen HF
- Prosjektkategori
- Forskerutdanning - dr.grad
- Helsekategori
- Cancer
- Forskningsaktivitet
- 2. Aetiology
Rapporter
MDM2 er et komplekst protein som interagerer og regulerer mange viktige komponenter i cellesyklus, deriblant det viktige tumor suppressor genet p53. Siden forhøyete nivåer av MDM2 har blitt observert i mange svulster, blir MDM2 genet klassifiser som et proto-oncogen. Det kan være flere grunner til at MDM2 genet blir overuttrykt, og i de siste 10 årene er det fokusert mye på genetiske varianter i promoteren som fører til endret uttrykking av MDM2. MDM2 genet inneholder mange genetiske varianter, såkalte single nucleotide polymorphisms (SNPs). Tidligere forskning har vist at en slik variant i MDM2 genet, SNP309 T>G, fører til økt uttrykking av MDM2, og er assosiert med tidligere diagnose og økt kreftrisiko, mens en annen variant, SNP285 G>C, medfører redusert uttrykking av MDM2, og er assosiert med redusert kreftrisiko. Det har også blitt vist at det er store etniske forskjeller i distribusjonen av disse variantene.
I dette prosjektet har SNP309 og SNP285, i tillegg til to andre potensielt funksjonelle varianter i MDM2 promoteren blitt studert, både med tanke på MDM2 uttrykking, kreftrisiko og etnisk distribusjon. Vi fant ingen assosiasjon mellom SNP309 og kreftrisiko for bryst-, tarm- eller prostatakreft, men vi observerte en redusert risiko for lungekreft hos kvinner som er heterozygote bærere av denne varianten. Som vi har vist tidligere, fant vi også i dette prosjektet en assosiasjon mellom SNP285C og redusert risk for brystkreft. Vi har også tidligere vist at SNP285C varianten var begrenset til Nordeuropeere. Her fant vi at varianten er tilstede over hele Europa, og har en minkende frekvens mot Midtøsten og østlige deler av Russland, mens den ikke er å finne hos Han-Kinesere, Mongoler eller Afrikanere. I tillegg estimerte vi at SNP285C har oppstått for 15000 år siden, og at den derfor har oppstått etter skillet mellom Europeere og Asiater i de store folkevandringene. Dette i tillegg til en invers korrelasjon mellom SNP285C og SNP309G indikerer at SNP285C er under positiv seleksjon. MDM2 del1518 er en indel variant på 40 basepar lokalisert i promoter P1. Del-allelet av denne varianten ble funnet assosiert med økt uttrykking av MDM2, og med økt risiko for tarmkreft, men ikke bryst-, lunge-, ovarie-, endometrie- eller prostatakreft. Distribusjonsanalyser viste at denne varianten fins i alle etniske grupper og at den også er bevart hos sjimpanser. MDM2 del1518 er derfor en svært gammel variant som muligens er under balansert seleksjon. For variant SNP344T>A fant vi ingen assosiasjon med verken endring i MDM2 uttrykking eller kreftrisiko. Alt i alt tyder våre funn på at MDM2, i tillegg til å ha en rolle i karsinogenese, også har/har hatt en viktig rolle i menneskets evolusjon.
Resultatene i dette prosjektet viser at bærere av MDM2 SNP285C allelet har en redusert risiko for brystkreft, og at denne varianten er en mulig konfunderende faktor i SNP309 kreftrisikoberegninger hos Europeere (Kaukasiere). Videre er det vist at del allelet av den genetiske varianten MDM2 del1518 er en mulig biomarkør for økt risiko for tarmkreft. I tillegg viser de siste preliminære resultatene at denne varianten også fører til økt risiko for ovariekreft hos BRCA1 mutasjonsbærere.
Brystkreft er den hyppigst forekommende kreftformen blant kvinner i den vestlige verden, og bare i Norge rammes omtrent 3000 kvinner hvert år. Selv om behandlingene, og dermed prognosene, har blitt merkbart forbedret, er det fremdeles en del kvinner som ikke responderer på cellegiftbehandling. Hvorfor det er slik, er fremdeles ukjent.I godt over 15 år har brystkreftgruppen ved Haukeland Universitetssykehus arbeidet med å finne årsaken(e) til resistens mot kjemoterapi hos kreftpasienter. I løpet av den tiden har gruppen, som de første i verden, vist at mutasjoner «i vaktmestergenet» TP53 er assosiert med cellegiftresistens hos brystkreftpasienter. I tillegg har gruppen vist at mutasjoner i retinoblastom-genet, Rb, også er assosiert med antracyklin-resistens. Imidlertid forklarer ikke dette behandlingsresistens i samtlige svulster. I de siste årene har hovedtyngden av arbeidet vært konsentrert rundt MDM2 genet. Mdm2 interagerer med både p53- og Rb proteinet, og siden MDM2 ofte er funnet overuttrykt i flere svulster mistenker man at MDM2 også er en bidragsyter til kjemoresistens.
MDM2 er et komplekst protein, som i tillegg til å interagere med p53 og Rb, også binder og regulerer andre viktige cellesyklus regulatorer. Fra MDM2 genet blir det også, i likhet med over 60 % av våre gener, dannet en rekke alternative spleisevarianter. Selv om det har vært kjent i mange år at det uttrykkes spleisevarianter fra MDM2 i både tumor- og normalvev, vet man svært lite om deres eventuelle biologiske funksjon. I MDM2 genet er det også funnet en rekke single nucleotide polymorphisms (SNP). Polymorfismer er normale genetiske variasjoner som forekommer med en viss hyppighet (minst 1%) av befolkingen. I 2004 viste et amerikansk forskningsteam at polymorfismen SNP309T>G ga førhøyede nivåer av MDM2, og at dette var assosiert med både kreft risiko og tidligere kreftutvikling. I 2011 rapporterte post doc Stian Knappskog i vår gruppe en sekundær polymorfisme i det samme området av MDM2 genet, SNP285G>C, som motvirker den negative funksjonen av SNP309 og dermed har en kreftbeskyttende effekt. I dette prosjektet jobber vi med å finne Mdm2 spleisevarianter og deres betydning i p53-MDM2-Rb kaskaden.
Har til nå karakterisert over 90 ulike spleisevarianter fra bestrålte og ubehandlede lymfocytter fra friske menn i 20 årene, av disse har vi selektert ut 10 stykker for kvantifisering før og etter stråling. I tillegg har vi undersøkt en tredje SNP, SNP344T>A, med tanke på kreft risiko. Her ble det ikke observert noen økt uttrykking av MDM2, og vi fant heller ingen korrelasjon mellom SNP og risk for kreft.
Kreft er et stor globalt helseproblem som medfører store kostnader og millioner av dødsfall hvert år. I følge Cancer Research UK ble det estimert at omtrent 12,7 millioner mennesker verden over ble rammet av kreft i 2008. Lungekreft var, og er, den kreftformen som rammer flest, mens brystkreft kommer inn som nummer to på listen med bortimot 1,4 millioner tilfeller.Brystkreft, som andre typer kreft, oppstår som et resultat av flere somatiske mutasjoner som akkumuleres over tid, der spesielt mutasjon i genet TP53 kan være en utløsende faktor. TP53 koder for proteinet p53, et nøkkelprotein i reguleringen av cellesyklus. p53 er funnet mutert i ~ 50 % av alle registrerte krefttilfeller, og i tilfeller der p53 ikke er mutert har det ofte vist seg at det er feil andre steder i p53 signalveien (1). Både for høye og for lave nivåer av p53 kan være skadelig, derfor blir p53 nøye regulert. Et av proteinene som er viktig i reguleringen av p53 er Mdm2 (Murine Double Minute 2). Mdm2 binder og merker p53 for nedbrytning og er dermed en negativ regulator av p53 (2,3). I flere svulstformer viser det seg at MDM2 genet er overuttrykt og at dette gir en effekt tilsvarende TP53 mutasjoner. Fra MDM2 genet blir det, i likhet med over 60 % av alle humane gener, dannet alternative spleisevarianter. For flere av disse genene er det postulert at alternative spleisevarianter er en viktig reguleringsmekanisme for proteinfunksjon. Selv om det har vært kjent i over 10 år at det utrykkes multiple spleisevarianter av MDM2 både i tumor- og normalvev, vet man pr i dag svært lite om deres eventuelle fysiologiske funksjon (4). I dette prosjektet ønsker vi å undersøke om uttrykkingen av MDM2 spleisevarianter kan ha en sammenheng med kjemoterapiresistens og da hvilke mekanismer som ligger til grunn for dette. Vi vil også granske eventuelle effekter MDM2 spleisevarianter har på gener nedstrøms i p53 signalveien.
Vi har opparbeidet et normalmateriale bestående av ubehandlede og IR bestrålte (3GY) lymfocytter renset fra blodprøver tatt av 220 friske unge menn. Fra dette materialet ble en sub gruppe på 12 benyttet til å lage et spleisevariantbibliotek, der vi karakteriserte spleisevarianter fra promotor P1 og P2 både fra ubehandlete og bestrålte prøver. I dette spleisevariantbiblioteket har vi pr i dag over 90 ulike spleisevarianter. På bakgrunn av hvilke bindingsdomener for andre proteiner spleisevariantene manglet, har vi plukket ut noen spleisevarianter for analyse på RT-qPCR (kvantifisering) før og etter bestråling. Disse analysene er pågående. For å kunne undersøke spleisevariantenes effekt på gener nedstrøms for p53 holder vi nå på å klone de overnevnte spleisevariantene inn i en ekspresjons vektor. Disse konstruktene er i øyeblikket under utprøving.
1. Rinn JL, Huarte M. To repress or not to repress: This is the guardian's question. Trends in Cell Biology 2011;21:344-53.
2. Momand J, Zambetti GP, Olson DC, George D, Levine AJ. The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell 1992;69:1237-45.
3. Haupt Y, Maya R, Kazaz A, Oren M. Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature 1997;387:296-9.
4. Bartel F, Taubert H, Harris LC. Alternative and aberrant splicing of MDM2 mRNA in human cancer. Cancer Cell 2002;2:9-15.
Brystkreft er den hyppigste kreftformen blant kvinner verden over og forårsaker omtrent 500 000 dødsfall hvert år. Norge har vist seg å være et av de landene med hyppigst forekomst av brystkreft, og hvert år blir omtrent 3000 kvinner diagnostisert med sykdommen.De mest vanlige behandlingsformene mot kreft er kirurgi, kjemoterapi (cellegift) og ioniserende stråling. I den siste tiden er det blitt mer og mer vanlig å starte behandlingen med kjemoterapi, dette for å redusere størrelsen på kreftsvulsten og for å bekjempe/motvirke mikrometastaser. Uheldigvis har det vist seg at flere kvinner er resistente mot kjemoterapi, noe som fører til at en del pasienter blir overbehandlet. Hvorfor noen er resistente mot behandling er fremdels ukjent. Hovedmålet i vår gruppe er å prøve å finne prediktive genetiske faktorer som kan selektere de brystkreftpasientene som vil dra nytte av ulike typer cellegiftbehandling
Brystkreft, som andre typer kreft, oppstår som et resultat av flere somatiske mutasjoner som akkumuleres over tid, der spesielt mutasjon i TP53 kan være en utløsende faktor. TP53 koder for proteinet p53, ofte kalt ”vokteren av genomet” da det er et nøkkelprotein i reguleringen av cellesyklus. p53 er funnet mutert i over 50 % av alle registrerte krefttilfeller, og i tilfeller der p53 ikke er mutert har det ofte vist seg at det er en feil andre steder i p53 pathveien. Både for høye og for lave nivåer av p53 kan være skadelig, derfor blir p53 nøye regulert av proteinet MDM2 (Murine Double Minute 2). MDM2 er et komplekst protein som, i tillegg til å binde og regulere p53, også binder og regulerer retinoblastom-proteinet (pRB), E2F1 og ARF. I flere svulstformer gir amplifikasjon av MDM2 genet en effekt tilsvarende TP53 mutasjoner, og nylig ble det funnet at økt uttrykking av MDM2, forårsaket av en polymorfisme i promotor-region P2, korrelerer med både økt kreft innsidens og tidlig sykdomsdebut.
Nylig er det også påvist multiple splice-varianter av MDM2, disse ser ut til å bli uttrykt fra begge av de to MDM2 promotorene og med en usymmetrisk fordeling. I dette prosjektet ønsker vi å kartlegge fordelingen av splice-varianter fra de to promotorene, identifisere/ karakterisere ulike splice-varianter og finne den biologiske funksjonen til de ulike splice-variantene (Hvilken rolle de spiller i evt apoptose, vekstarrest eller senesence).
Vi har til rådighet 220 blodprøver fra friske menn. Fra dette materialet ble en subgruppe på 12 benyttet til å lage et splice bibliotek, der vi karakteriserte splice-varianter fra promotor P1 og P2 både i ubehandlede og bestrålte prøver. Pr i dag har vi kartlagt til sammen over 90 ulike splice-varianter, og vi kan se et mønster i splice variasjonene med hensyn på bestråling. Av de 90 ulike observerte splice-variantene er det noen som synes generelle og er til stede under alle undersøkte forhold, mens andre er spesifikke for enten ubehandlede eller bestrålte situasjoner. De generelle splice-variantene er brukt som mal for å designe forsøk for kvantifisering av splice-variant nivåer i ubehandlede og bestrålte prøver. Disse analysene er pågående, og så langt lovende.
Vitenskapelige artikler
Knappskog Stian, Gansmo Liv B, Romundstad Pål, Bjørnslett Merete, Trovik Jone, Sommerfelt-Pettersen Jan, Løkkevik Erik, eUtils.ItemsChoiceType2[], Tollenaar Rob A E M, Seynaeve Caroline, Devilee Peter, Salvesen Helga B, Dørum Anne, Hveem Kristian, Vatten Lars, Lønning Per E
MDM2 promoter SNP344T>A (rs1196333) status does not affect cancer risk.
PLoS One 2012;7(4):e36263. Epub 2012 apr 30
PMID: 22558411 - Inngår i doktorgradsavhandlingen
Doktorgrader
Liv Beathe Gansmo
MDM2 polymorphisms; the impact of four promoter variants on cancer risk
- Disputert:
- desember 2013
- Hovedveileder:
- Per Eystein Lønning
Deltagere
- Stian Knappskog Medveileder
- Per Eystein Lønning Hovedveileder
- Liv Beathe Gansmo Ph.d.-kandidat
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til Faglig rapportering, Helse Vest