A proteomic approach to mechanisms for chronic fatigue
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 911613
- Ansvarlig person
- Eivind Larssen
- Institusjon
- Helse Stavanger HF
- Prosjektkategori
- Forskerutdanning - dr.grad
- Helsekategori
- Inflammatory and Immune System
- Forskningsaktivitet
- 4. Detection and Diagnosis
Rapporter
Kronisk fatigue er en tilstand som rammer over 80% av mennesker som har en autoimmun sykdom. Årsaken til dette er ikke kjent. Forskning tyder på at det er andre mekanismer som gjør seg gjeldene ved denne tilstanden enn ved den autoimmune tilstanden. Det er nærliggende å tro at det er mekanismer i hjernen som er årsak til kronisk fatigue.CSF er en klar væske med ett proteininnhold på 0,2-0,5 mg/ml. De 4 mest dominerende proteinene i CSF utgjør mer enn 80% av totalprotein i væsken. For å kunne detektere og identifisere proteiner av interesse, som ofte finnes i lave konsentrasjoner i CSF, må de dominerende proteinene fjernes.
Vi har utviklet et "High Abundance Protein" depletion system (HAP depletion system). Et automatisert system som fjerner de mest dominerende proteinene i CSF, og som samler opp fraksjonen som inneholder de resterende proteinene. Fraksjoner fra fra HAP depletion systemet og fra fellingsmetoden blir videre opparbeidet for klargjøring til massespektrometri for protein identifisering (MS/MS – LTQ Orbitrap).
Semikvantitative analyser utføres ved å ekstrahere «Peptide Spectrum Matches» (PSMs) fra datasettet, disse verdiene blir videre importert inn i SIRIUS for multivariate analyser. SIRIUS er et software utviklet av Prof. O. Kvalheim ved Universitet i Bergen
Vi har funnet ut at fellingsmetoden med bruk av 80 % acetonitrile er tilfredstillende både når det gjelder effektivitet og reproduserbarhet. Trypsin kutter proteiner og den tradisjonelle måten å gjøre dette på er i en vandig løsning over natt (ca. 16 timer) i 37 grader celcius. Vi viser at trypsineringen er mer reproduserbar i 80 % acetonitrile i kun en time.
Vi har også vist at vi med denne metoden kan skille pasienter som lider av multiple sclerosis (MS) fra friske individer. Resultatene fra denne studien er publisert i journalen Proteomics:
"A rapid method for preparation of the cerebrospinal fluid proteome" Larssen et al. 2015 - Proteomics. 2015 Jan;15(1):10-5. doi: 10.1002/pmic.201400096. Epub 2014 Dec 3.
CSF fra 20 individer med pSS (primary Sjøgrens Syndrom), 10 med høy fatigue og 10 med lav fatigue, har blitt analysert ved hjelp av MARS Hu 14 kolonnen og påfølgende massespektrometri. PSM verdier har blitt importert inn i SIRIUS, standardisert og videre analysert ved hjelp Principal Component Analysis (PCA) og Partial Least Square-Discrimination Analysis (PLS-DA). Resultatene er lovende, interessante proteiner bidrar til separasjon mellom de to gruppene (Høy- vs. Lav fatigue). Proteinene som er funnet å være av interesse inngår i reaksjonsveier som i høy grad er viktige for immunsystemet og aktivering ved inflammasjon.
Disse resultatene vil danne grunnlaget for publikasjonen (foreløpig tittel): "Fatigue in primary Sjögrens´s syndrome; a proteomic study of the cerebrospinal fluid"
Prosjektet går ut på å finne mekanismer for kronisk fatigue ved hjelp av proteomiske metoder. Våre verktøy er kromatografi og massespektrometri. Vårt råmateriale er cerebrospinalvæske.Kronisk fatigue er en tilstand som rammer over 80% av mennesker som har en autoimmun sykdom. Årsaken til dette er ikke kjent. Forskning tyder på at det er andre mekanismer som gjør seg gjeldene ved denne tilstanden enn ved autoimmune tilstander. Det er nærliggende å tro at det er mekanismer i hjernen som er årsak til kronisk fatigue og at dette vil gjenspeiles i cerebrospinalvæsken (CSF) som omkranser hjerne og ryggmarg. Molekylære endringer fra normalaktivitet i hjernen vil trolig kunne detekteres i CSF. Dette fordi molekyler krysser blod-hjerne barrieren.
CSF er en klar væske med ett proteininnhold på 0,2-0,5 mg/ml. De 4 mest dominerende proteinene i CSF utgjør mer enn 80% av totalprotein i væsken. For å kunne detektere og identifisere proteiner av interesse, som ofte finnes i lave konsentrasjoner i CSF, må de dominerende proteinene fjernes.
Vi har utviklet et "High Abundance Protein" depletion system (HAP depletion system). Et automatisert system som fjerner de mest dominerende proteinene i CSF, og som samler opp fraksjonen som inneholder de resterende proteinene.
Vi har gått til innkjøp av en MARS-Hu 14 kolonne, denne fjerner 14 av de mest dominerende poteinene. Denne er koblet til depletion systemet nevnt over. Parallelt tester vi også ut en ny fellingsmetode. Denne metoden går ut på å felle proteiner med 80 % acetonitrile.
Fraksjoner fra fra HAP depletion systemet og fra fellingsmetoden blir videre opparbeidet for klargjøring til massespektrometri for protein identifisering (MS/MS – LTQ Orbitrap).
Semikvantitative analyser utføres ved å ekstrahere «Peptide Spectrum Match» (PSM) fra datasettet, disse verdiene blir videre importert inn i SIRIUS for multivariat statistikk analyser. SIRIUS er et software utviklet av Prof. O. Kvalheim ved Universitet i Bergen
Vi har funnet ut at fellingsmetoden med bruk av 80 % acetonitrile er tilfredstillende både når det gjelder effektivitet og reproduserbarhet. Trypsin kutter proteiner og den tradisjonelle måten å gjøre dette på er i en vandig løsning over natt (ca. 16 timer) i 37 grader celcius. Vi viser at trypsineringen er mer reproduserbar i 80 % acetonitrile i kun en time.
Vi har også vist at vi med denne metoden kan skille pasienter som lider av multiple sclerosis (MS) fra friske individer. Resultatene fra denne studien er under innsending til journalen "Proteomics". Artikkelen har fått tittelen "A rapid method for preparation of the cerebrospinal fluid proteome".
CSF fra 20 individer med pSS (primary Sjøgrens Syndrom), 10 med høy fatigue og 10 med lav fatigue, har blitt analysert ved hjelp av MARS Hu 14 kolonnen og påfølgende massespektrometri. PSM verdier har blitt importert inn i SIRIUS, standardisert og videre analysert ved hjelp Principal Component Analysis (PCA) og Partial Least Square-Discrimination Analysis (PLS-DA). Resultatene virker lovende, en rekke interessante proteiner bidrar til separasjon mellom de to gruppene (Høy- vs. Lav fatigue).
Disse resultatene vil danne grunnlaget for neste publikasjon og for neste steg i prosjektet som trolig vil være "targeted proteomics".
Når vi vet hvilke proteiner vi skal se etter (targeted proteomics) kan vi endre både instrumentelle og analytiske parametre, sensitivitetet og selektivitet vil bli bedre. Dette vil styrke resultatene i vårt prosjekt.
Prosjektet går ut på å finne mekanismer for kronisk fatigue ved hjelp av proteomiske metoder. Våre verktøy er kromatografi og massespektrometri. Vårt råmateriale er cerebrospinalvæske.Kronisk fatigue er en tilstand som rammer over 80% av mennesker som har en autoimmun sykdom. Årsaken til dette er ikke kjent. Forskning tyder på at det er andre mekanismer som gjør seg gjeldene ved denne tilstanden enn ved autoimmune tilstander. Det er nærliggende å tro at det er mekanismer i hjernen som er årsak til kronisk fatigue og at dette vil gjenspeiles i cerebrospinalvæsken (CSF) som omkranser hjerne og ryggmarg. Molekylære endringer fra normalaktivitet i hjernen vil trolig kunne detekteres i CSF. Dette fordi molekyler krysser blod-hjerne barrieren.
CSF er en klar væske med ett proteininnhold på 0,2-0,5 mg/ml. De 4 mest dominerende proteinene i CSF utgjør mer enn 80% av totalprotein i væsken. For å kunne detektere og identifisere proteiner av interesse, som ofte finnes i lave konsentrasjoner i CSF, må de dominerende proteinene fjernes.
Vi har utviklet et "High Abundance Protein" depletion system (HAP depletion system). Et automatisert system som fjerner de mest dominerende proteinene i CSF, og som samler opp fraksjonen som inneholder de resterende proteinene.
Vi har nå gått til innkjøp av en MARS-Hu 14 kolonne, denne fjerner 14 av de mest dominerende poteinene. Denne er koblet til depletion systemet nevnt over. Parallelt tester vi også ut en ny fellingsmetode. Denne metoden går ut på å felle proteiner med 80 % acetonitrile. Preliminære resultater virker lovende.
Fraksjoner fra fra HAP depletion systemet og fra fellingsmetoden blir videre opparbeidet for klargjøring til massespektrometri for protein identifisering (MS/MS – LTQ Orbitrap).
Semikvantitative analyser utføres ved å ekstrahere «Spectral Counts» fra datasettet, disse normaliseres og «Fold Change» blir kalkulert. Videre importeres datasettet inn i SIRIUS for multivariat statistikk analyser. SIRIUS er et software utviklet av Prof. O. Kvalheim ved Universitet i Bergen
Prosjektet går ut på å finne mekanismer for kronisk fatigue ved hjelp av proteomiske metoder. Våre verktøy er kromatografi og massespektrometri. Vårt råmateriale er cerebrospinalvæske.Kronisk fatigue er en tilstand som rammer over 80% av mennesker som har en autoimmun sykdom. Årsaken til dette er ikke kjent. Forskning tyder på at det er andre mekanismer som gjør seg gjeldene ved denne tilstanden enn ved autoimmune tilstander. Det er nærliggende å tro at det er mekanismer i hjernen som er årsak til kronisk fatigue og at dette vil gjenspeiles i cerebrospinalvæsken (CSF) som omkranser hjerne og ryggmarg. Molekylære endringer fra normalaktivitet i hjernen vil trolig kunne detekteres i CSF. Dette fordi molekyler krysser blod-hjerne barrieren.
CSF er en klar væske med ett proteininnhold på 0,2-0,5 mg/ml. De 4 mest dominerende proteinene i CSF utgjør mer enn 80% av totalprotein i væsken. For å kunne detektere og identifisere proteiner av interesse, som ofte finnes i lave konsentrasjoner i CSF, må de dominerende proteinene fjernes.
Vi har utviklet et "High Abundance Protein" depletion system (HAP depletion system). Et automatisert system som fjerner 7 av de mest dominerende proteinene i CSF, og som samler opp fraksjonen som inneholder de resterende proteinene.
Vi har festet antistoffer mot de 7 mest dominerende proteinene til partikler (toyopearl) og pakket disse i en kromatografisk kolonne. Denne blir så koblet til en væskekromatograf, som igjen er koblet til en "switch" ventil, en C18-trap kolonne, en sekundær pumpe og en fraksjonssamler.
Oppsamlet proteinfraksjon blir så trypsinert før identifisering på massespektrometer (LTQ-Orbitrap).
Har brukt tid på trypsineringsmetode og for å få denne reproduserbar. Har kommet fram til at trypsinering i 80 % acetonitrile i 1 time gir veldig repsoduserbare resultater.
Semikvantitative analyser av proteindata er gjort med hjelp av "spectral counts"
Hvert steg i analysen har blitt validert med tanke på reproduserbarhet.
Optimaliserings- og valideringsperioden er nå inne i siste fase og pasientprøver vil bli analysert på disse systemene om kort tid.
Målet med prosjektet er å utforske og karakterisere biologiske mekanismer for kronisk fatigue syndrom (CFS) hos mennesker med autoimmune sykdommer. Vi har ett unikt prøvemateriale av cerebrospinalvæske for dette formålet og vi vil bruke ny proteomikk teknologi for å oppnå dette.Prosjektets Hovedmål:
1. Metode optimalisering for prøveopparbeidelse, fraksjonering og protein analyse av cerebrospinalvæske.
2. Protein ekspresjon signaturer hos fatigue pasienter ved hjelp av “top-down” og “bottom-up” proteomikk.
3. Identifisering av molekyler spesifikke for fatigue ved hjelp av multivariat statistikk, samt validering av mekanisme, funksjon og reaksjonsvei ved hjelp av bioinformatiske verktøy.
4. Korrelasjon av endring i proteomet med kliniske data og resultater fra tradisjonelle metoder, koble resultat til patogenese og sykdomsmekanisme.
Prosjektet er nå inne i optimaliseringsfasen (se pkt. 1). Spinalvæske inneholder ca. 0,5 g/l proteiner og hoveddelen av disse er det som kalles ”High Abundance Proteins”, eller HAP. For å utforske spinalvæske proteomet må disse HAP`ene fjernes. Dette fordi de overskygger for resten av proteomet i protein analyser.
Vi har testet ulike metoder for fjerning av HAP: utfelling, spinnkolonner og kromatografi. Metodene er beskrevet i vitenskapelige publikasjoner, men vår erfaring er at det er få av dem som er reproduserbare. Vi har oppnådd gode resultater i noen av analysene, men finner det ikke tilfredsstillende.
Vi samarbeider nå med Dr. Cato Brede (Avd. for Medisinsk Biokjemi, SUS) som har satt opp ett system for automatisk HAP fjerning basert på immunoaffinitet. Dette systemet har gitt gode resultater og vi vil fortsette med optimalisering på dette instrumentet. Automatisk HAP fjerning er å fortrekke da dette forbedrer reproduserbarheten betraktelig slik at vi kan ha tillit til resultatene.
Deltagere
- Roald Omdal Hovedveileder
- Eivind Larssen Ph.d.-kandidat
- Peter Ruoff Medveileder
- Anne Hjelle Medveileder
- Cato Brede Medveileder
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til Faglig rapportering, Helse Vest