Betydning av MDM2 splicevarianter for induksjon av apoptose/senescence i normalvev og brystkreftsvulster samt respons på genotoksisk stress (cytostatika og strålebehandling)
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 911636
- Ansvarlig person
- Bård Mannsåker
- Institusjon
- Helse Bergen HF
- Prosjektkategori
- Forskerutdanning - dr.grad
- Helsekategori
- Cancer
- Forskningsaktivitet
- 2. Aetiology
Rapporter
Mange av de store fremskritt innen kreftbehandlingen det siste tiåret er kommet som følge av økt forståelse av genetiske og molekylærbiologiske forskjeller mellom kreftsvulster og de mulighetene dette gir for målrettet behandling mot svulstene sine hovedkarakteristika og individuelt tilpasset behandling av kreftpasienteneBrystkreftgruppen ved Haukeland Universitetssykehus har i nærmere 20 år undersøkt mekanismer for behandlingsresistens mot cellegift hos kreftpasienter. Gruppen har bl.a. vist at ulike defekter i to sentrale signalveier som kontrollerer celledeling, p53- og Rb-signalveiene, er å finne hos pasienter som ikke har tilfredsstillende effekt av cellegift. Man har imidlertid ikke kunnet finne en årsak til behandlingsresistens hos samtlige pasienter i studiene som er gjort så langt. Mye oppmerksomheter nå knyttet til Mdm2-genet som er vist å kunne spille en avgjørende betydning i begge de to nevnte signalveiene. Mdm2-genet blir uttrykt i mange forskjellige varianter ved et fenomen som kalles splicing. Det finnes fremdeles lite kunnskap om betydningen av de ulike splicevariantene, og fokus for dette prosjektet er å undersøke betydningen av tilstedeværelsen av ulike slike splicevarianter i forbindelse med brystkreft og behandlingsresistens. Første del av prosjektet besto i å identifisere de mest interessante Mdm2 splicevariantene mhp hvilke varianter som er tilstede i kreftceller og hvilke varianter som påvirkes (ved opp- eller ned-regulering) som følge av kjemoterapi. Etter at dette var gjennomført måtte man utvikle pålitelige målemetoder (variant-spesifikke qPCR assays) for å undersøke nivåene av disse splicevariantene i ulike biologiske prøver. For 6 av de mest interessante splicevariantene har det lyktes å etablere robuste assay for dette. En målsetning er å identifisere forskjeller i nivå av de ulike splicevarianter i forskjellige vev, samt før og etter behandling av kreftceller med vanlige cytostatika. Vi har derfor gjennomført forsøk hvor celler fra ulike typer kreftvev har blitt utsatt for doxorubicin og cisplatin. Disse forsøkene inkluderer også en omfattende analyse av variasjoner som følge av ulike doser cellegift, samt behandlingstid. Nivåene av flere av de undersøkte splicevariantene synes å bli regulert som følge av eksponeringen for cellegift. Arbeidet er gjennomført i immortaliserte kreftcellekulturer. Nivåene av splicevarianter er også undersøkt i blodceller donert fra friske personer. Et betydelig arbeid er lagt ned i funksjonelle studier for å forstå eventuelle forskjeller i regulering av cellesyklus i brystkreftceller mellom full-lengde Mdm2 og 5 av splicevariantene. Dette arbeidet er utført ved transfeksjon av immortaliserte brystkreftceller med overuttrykking av Mdm2 eller en av splicevariantene som resultat. Det er utført en rekke eksperimenter for å danne seg et klart bilde av hvordan regulering av splicevariantene kan virke inn på respons av cellegiftbehandling og resultatene er nå under bearbeiding og sammenskriving for publisering. Dersom man er i stand til å identifisere betydning av Mdm2-splicevarianter for sykdomsutvikling og/eller behandlingsrespons, vil man på sikt ha forhåpninger om å kunne ta hensyn til dette i behandlingen av brystkreftpasientene ved å tilby en mer individualisert behandling.
Mange av de store fremskritt innen kreftbehandlingen det siste tiåret er kommet som følge av økt forståelse av genetiske og molekylærbiologiske forskjeller mellom kreftsvulster og de mulighetene dette gir for målrettet behandling mot svulstene sine hovedkarakteristika og individuelt tilpasset behandling av kreftpasienteneBrystkreftgruppen ved Haukeland Universitetssykehus har i nærmere 20 år undersøkt mekanismer for behandlingsresistens mot cellegift hos kreftpasienter. Gruppen har bl.a. vist at ulike defekter i to sentrale signalveier som kontrollerer celledeling, p53- og Rb-signalveiene, er å finne hos pasienter som ikke har tilfredsstillende effekt av cellegift. Man har imidlertid ikke kunnet finne en årsak til behandlingsresistens hos samtlige pasienter i studiene som er gjort så langt.
Mye oppmerksomheter nå knyttet til Mdm2-genet som er vist å kunne spille en avgjørende betydning i begge de to nevnte signalveiene. Mdm2-genet blir uttrykt i mange forskjellige varianter ved et fenomen som kalles splicing. Det finnes fremdeles lite kunnskap om betydningen av de ulike splicevariantene, og fokus for dette prosjektet er å undersøke betydningen av tilstedeværelsen av ulike slike splicevarianter i forbindelse med brystkreft og behandlingsresistens. Første del av prosjektet besto i å identifisere de mest interessante Mdm2 splicevariantene mhp hvilke varianter som er tilstede i kreftceller og hvilke varianter som påvirkes (ved opp- eller ned-regulering) som følge av kjemoterapi. Etter at dette var gjennomført måtte man utvikle pålitelige målemetoder (variant-spesifikke qPCR assays) for å undersøke nivåene av disse splicevariantene i ulike biologiske prøver. For 6 av de mest interessante splicevariantene har det lyktes å etablere robuste assay for dette. En målsetning er å identifisere forskjeller i nivå av de ulike splicevarianter i forskjellige vev, samt før og etter behandling av kreftceller med vanlige cytostatika. Vi har derfor gjennomført forsøk hvor celler fra ulike typer kreftvev har blitt utsatt for doxorubicin og cisplatin. Disse forsøkene inkluderer også en omfattende analyse av variasjoner som følge av ulike doser cellegift, samt behandlingstid. Nivåene av flere av de undersøkte splicevariantene synes å bli regulert som følge av eksponeringen for cellegift. Arbeidet er gjennomført i immortaliserte kreftcellekulturer. Nivåene av splicevarianter er også undersøkt i blodceller donert fra friske personer.
Et betydelig arbeid er lagt ned i funksjonelle studier for å forstå eventuelle forskjeller i regulering av cellesyklus i brystkreftceller mellom full-lengde Mdm2 og 5 av splicevariantene. Dette arbeidet er utført ved transfeksjon av immortaliserte brystkreftceller med overuttrykking av Mdm2 eller en av splicevariantene som resultat. Det er utført en rekke eksperimenter for å danne seg et klart bilde av hvordan regulering av splicevariantene kan virke inn på respons av cellegiftbehandling og resultatene er nå under bearbeiding og sammenskriving for publisering.
Dersom man er i stand til å identifisere betydning av Mdm2-splicevarianter for sykdomsutvikling og/eller behandlingsrespons, vil man på sikt ha forhåpninger om å kunne ta hensyn til dette i behandlingen av brystkreftpasientene ved å tilby en mer individualisert behandling.
Mange av de store fremskritt innen kreftbehandlingen det siste tiåret er kommet som følge av økt forståelse av genetiske og molekylærbiologiske forskjeller mellom kreftsvulster og de mulighetene dette gir for målrettet behandling mot svulstene sine hovedkarakteristika og individuelt tilpasset behandling av kreftpasienteneBrystkreftgruppen ved Haukeland Universitetssykehus har i nærmere 20 år undersøkt mekanismer for behandlingsresistens mot cellegift hos kreftpasienter. Gruppen har bl.a. vist at ulike defekter i to sentrale signalveier som kontrollerer celledeling, p53- og Rb-signalveiene, er å finne hos pasienter som ikke har tilfredsstillende effekt av cellegift. Man har imidlertid ikke kunnet finne en årsak til behandlingsresistens hos samtlige pasienter i studiene som er gjort så langt. Mye oppmerksomhet er nå knyttet til Mdm2-genet som er vist å kunne spille en avgjørende betydning i begge de to nevnte signalveiene. Mdm2-genet blir uttrykt i mange forskjellige varianter ved et fenomen som kalles splicing. Det finnes fremdeles lite kunnskap om betydningen av de ulike splicevariantene, og fokus for dette prosjektet er å undersøke betydningen av tilstedeværelsen av ulike slike splicevarianter i forbindelse med brystkreft og behandlingsresistens.
Første del av prosjektet besto i å identifisere de mest interessante Mdm2 splicevariantene mhp hvilke varianter som er tilstede i kreftceller og hvilke varianter som påvirkes (ved opp- eller ned-regulering) som følge av kjemoterapi. Etter at dette var gjennomført måtte man utvikle pålitelige målemetoder (variant-spesifikke qPCR assays) for å undersøke nivåene av disse splicevariantene i ulike biologiske prøver. For 6 av de mest interessante splicevariantene har det lyktes å etablere robuste assay for dette. En målsetning er å identifisere forskjeller i nivå av de ulike splicevarianter i forskjellige vev, samt før og etter behandling av kreftceller med vanlige cytostatika. Vi har derfor gjennomført forsøk hvor celler fra ulike typer kreftvev har blitt utsatt for doxorubicin og cisplatin. Disse forsøkene inkluderer også en omfattende analyse av variasjoner som følge av ulike doser cellegift, samt behandlingstid. Nivåene av flere av de undersøkte splicevariantene synes å bli regulert som følge av eksponeringen for cellegift. Arbeidet er gjennomført i immortaliserte kreftcellekulturer. Nivåene av splicevarianter er også undersøkt i blodceller donert fra friske personer. Man vil basert på resultatene av dette deretter vurdere i hvilken grad man skal bruke Brystkreftgruppens pasientmateriale til videre kartlegging av dette.
Et betydelig arbeid er lagt ned i funksjonelle studier for å forstå eventuelle forskjeller i regulering av cellesyklus i brystkreftceller mellom full-lengde Mdm2 og 5 av splicevariantene. Dette arbeidet er utført ved transfeksjon av immortaliserte brystkreftceller med overuttrykking av Mdm2 eller en av splicevariantene som resultat. Noe arbeid gjenstår for å danne seg et klart bilde av hvordan regulering av splicevariantene kan virke inn på respons av cellegiftbehandling.
Dersom man er i stand til å identifisere betydning av Mdm2-splicevarianter for sykdomsutvikling og/eller behandlingsrespons, vil man på sikt ha forhåpninger om å kunne ta hensyn til dette i behandlingen av brystkreftpasientene ved å tilby en mer individualisert behandling.
Mange av de store fremskritt innen kreftbehandlingen det siste tiåret er kommet som følge av økt forståelse av genetiske og molekylærbiologiske forskjeller mellom kreftsvulster og de mulighetene dette gir for målrettet behandling mot svulstene sine hovedkarakteristika og individuelt tilpasset behandling av kreftpasientene.Brystkreftgruppen ved Haukeland Universitetssykehus har i nærmere 20 år undersøkt mekanismer for behandlingsresistens mot cellegift hos kreftpasienter. Gruppen har bl.a. vist at ulike defekter i to sentrale signalveier som kontrollerer celledeling, p53- og Rb-signalveiene, er å finne hos pasienter som ikke har tilfredsstillende effekt av cellegift. Man har imidlertid ikke kunnet finne en årsak til behandlingsresistens hos samtlige pasienter i studiene som er gjort så langt. Mye oppmerksomhet er nå knyttet til Mdm2-genet som er vist å kunne spille en avgjørende betydning i begge de to nevnte signalveiene. Mdm2-genet blir uttrykt i mange forskjellige varianter ved et fenomen som kalles splicing. Det finnes fremdeles lite kunnskap om betydningen av de ulike splicevariantene, og fokus for dette prosjektet er å undersøke betydningen av tilstedeværelsen av ulike slike splicevarianter i forbindelse med brystkreft og behandlingsresistens.
Første del av prosjektet besto i å identifisere de mest interessante Mdm2 splicevariantene mhp hvilke varianter som er tilstede i kreftceller og hvilke varianter som påvirkes (ved opp- eller ned-regulering) som følge av kjemoterapi. Etter at dette var gjennomført måtte man utvikle pålitelige målemetoder (variant-spesifikke qPCR assays) for å undersøke nivåene av disse splicevariantene i ulike biologiske prøver. For 6 av de mest interessante splicevariantene har det lyktes å etablere robuste assay for dette. En målsetning er å identifisere forskjeller i nivå av de ulike splicevarianter i forskjellige vev, samt før og etter behandling av kreftceller med vanlige cytostatika. Vi har derfor gjennomført forsøk hvor celler fra ulike typer kreftvev har blitt utsatt for doxorubicin og cisplatin. Disse forsøkene inkluderer også en omfattende analyse av variasjoner som følge av ulike doser cellegift, samt behandlingstid. Nivåene av flere av de undersøkte splicevariantene synes å bli regulert som følge av eksponeringen for cellegift. Arbiedet er gjennomført i immortaliserte kreftcellekulturer, og for tiden pågår det undersøkelser av nivåene av splicevarianter i blodceller donert fra friske personer. Man vil basert på resultatene av dette deretter vurdere i hvilken grad man skal bruke Brystkreftgruppens pasientmateriale til videre kartlegging av dette.
Et betydelig arbeid er det seneste året lagt ned i funksjonelle studier for å forstå eventuelle forskjeller i regulering av cellesyklus i brystkreftceller mellom full-lengde Mdm2 og 5 av splicevariantene. Dette arbeidet er utført ved transfeksjon av immortaliserte brystkreftceller med overuttrykking av Mdm2 eller en av splicevariantene som resultat. Noe arbeid gjenstår for å danne seg et klart bilde av hvordan regulering av splicevariantene kan virke inn på respons av cellegiftbehandling.
Dersom man er i stand til å identifisere betydning av Mdm2-splicevarianter for sykdomsutvikling og/eller behandlingsrespons, vil man på sikt ha forhåpninger om å kunne ta hensyn til dette i behandlingen av brystkreftpasientene ved å tilby en mer individualisert behandling.
Mange av de store fremskritt innen kreftbehandlingen de senere årene er kommet som følge av muligheter til å gi kreftpasienter mer individualisert behandling. For å oppnå slike fremskritt er det nødvendig å skaffe til veie kunnskap om genetiske og molekylærbiologiske ulikheter mellom pasientene og å undersøke hvilken betydning disse ulikhetene har for prognose og behandlingsrespons.Brystkreftgruppen ved Haukeland Universitetssykehus har i nærmere 20 år undersøkt mekanismer for behandlingsresistens mot cellegift hos kreftpasienter. Gruppen har bl.a. vist at ulike defekter i to sentrale signalveier som kontrollerer celledeling, p53- og Rb-signalveiene, er å finne hos pasienter som ikke har tilfredsstillende effekt av cellegift. Man har imidlertid ikke kunnet finne en årsak til behandlingsresistens hos samtlige pasienter i studiene som er gjort så langt. Mye oppmerksomhet er nå knyttet til Mdm2-genet som er vist å kunne spille en avgjørende betydning i begge de to nevnte signalveiene. Mdm2-genet blir uttrykt i mange forskjellige varianter ved et fenomen som kalles splicing. Det finnes lite kunnskap om betydningen av de ulike splicevariantene, og fokus for dette prosjektet er å undersøke betydningen av tilstedeværelsen av ulike slike splicevarianter i forbindelse med brystkreft og behandlingsresistens.
Første del av prosjektet har bestått i å identifisere de mest interessante Mdm2 splicevariantene mhp hvilke varianter som er tilstede i kreftceller og hvilke varianter som påvirkes (ved opp- eller ned-regulering) som følge av kjemoterapi. Dette arbeidet er nå fullført og det jobbes videre med 8 varianter i eksperimentelle systemer, samt i materiale fra kreftpasienter. Videre har man lagt fokus på å utvikle pålitelige målemetoder (variant-spesifikke qPCR assayas) for nivåene av disse splicevariantene i ulike biologiske prøver. En målsetning er å identifisere forskjeller i nivå av de ulike splicevarianter i forskjellige vev, samt før og etter behandling av kreftceller med vanlige cytostatika. Vi har derfor også gjennomført forsøk hvor celler fra ulike typer kreftvev har blitt utsatt for doxorubicin og cisplatin. Disse forsøkene inkluderer også en omfattende analyse av variasjoner som følge av ulike doser cellegift, samt behandlingstid. Dette materialet blir for tiden undersøkt i immortaliserte cellekulturer, og data generert vil brukes videre til videre analyser i cancer-biopsimateriale fra allerede etablerte biobanker i gruppen.
Dersom man er i stand til å identifisere betydning av ulike Mdm2-splicevarianter for sykdomsutvikling og/eller behandlingsrespons, vil man på sikt ha forhåpninger om å kunne ta hensyn til dette i behandlingen av brystkreftpasientene ved å tilby en mer individualisert behandling.
Fullstendig tittel på prosjektet er "Betydning av MDM2 splicevarianter for induksjon av apoptose/senescense i normalvev og brystkreftsvulster samt respons på genotoksisk stress"Prosjektet er et ph D – prosjekt som er en del av virksomheten ved Brystkreftgruppen ved Avd. for kreftbehandling og medisinsk fysikk, Haukeland US. Brystkreftgruppen har i mer enn 15 år arbeidet med resistensmekanismer ved kjemoterapi med spesiell vekt på bruk av antracykliner ved brystkreft. Gruppen var således den første i verden som viste at mutasjoner i vaktmester-genet TP53 var assosiert med antracyklin-resistens ved brystkreft (1).
Ikke alle TP53-muterte svulster oppviser kjemoresistens. I tillegg kan kjemoresistens foreligge i enkelte tumorer med villtype TP53 samt villtype-status for andre gener som kan representere mekanismer for kjemoresistens mediert gjennom inaktivering av p53-signalveien. Basert på disse observasjonene har gruppen arbeidet med den hypotesen at TP53 må spille på ”lag” med minst en alternativ signalvei med tanke på indusert celledød under antracyklinbehandling. En klarlegging av slike mekanismer vil ha meget stor betydning med tanke på videre terapiutvikling for flere kreftsykdommer.
Som ”alternativ signalvei” har gruppen konsentrert interessen rundt det såkalte retinoblastom-genet (RB1), samt gener involvert i aktivering / hemning av retinoblastom-proteinet (pRb). MDM2-genet som blir studert i dette doktorgradsprosjektet og dets protein (mdm2) har en mulig nøkkelrolle i denne funksjon, da mdm2-proteinet regulerer både p53 og retinoblastomproteinets funksjoner.
Mdm2-proteinet inaktiverer p53 både ved hjelp av direkte binding og ved ubiquitinering (2). I tillegg er det eksperimentell evidens for at Mdm2 inaktiverer retinoblastom-proteinet (3). Det har vært kjent i vel 10 år at MDM2-genet uttrykker multiple alternative splice-varianter (4), en del med selektiv utspleising av bindingssetet for enten retinoblastom-proteinet eller p53. Selv om splice-fenomenet er velkjent, og enkelte studier så langt har karakterisert potensielle biologiske effekter av splice-varianter, er kunnskapen med tanke på funksjonell betydning av splicing generelt og med henblikk på MDM2 spesielt så langt begrenset og fragmentarisk.
Mål for doktorgradsprosjektet er å karakterisere mønsteret for mdm2 i brystkreftsvulster og sammenholde dette med både normale lymfocytter, men også normalt humant brystvev. Deretter er planen å studere endringer i dette splice-mønsteret i relasjon til akutt antracyklin-eksponering i brystkreftsvulster med tanke på kartlegging av atypiske mønstre opp mot normalvev for deretter å kunne identifisere enkelt varianter og / eller mønster av splicevarianter som er assosiert med respons på behandling.
I løpet av prosjektets første 10 måneder har man brukt tid på å identifisere ulike splicevarianter av MDM2-transkript som kan være relevante for videre studier. Man har benyttet immortaliserte celler i kultur for kartlegging av splicemønsteret ubehandlet samt etter at cellene er utsatt for cytostatika i enkle eksperimentelle oppsett. Denne delen av studien er nå ferdigstilt og har gitt et godt grunnlag for videre analyser.
1. Aas T, Børresen A-L, Geisler S, Smith-Sørensen B, Johnsen H, Varhaug JE, et al. Specific P53 mutations are associated with de novo resistance to doxorubicin in breast cancer patients. Nature Med1996;2:811-4.
2. Toledo F, Wahl GM. Regulating the p53 pathway: in vitro hypotheses, in vivo veritas. Nature Reviews Cancer2006 Dec;6(12):909-23.
3. Xiao Z-X, Chen J, Levine AJ, Modjtahedl N, Xing J, Sellers WR, et al. Interaction between the retinoblastoma protein and the oncoprotein MDM2. Nature1995;375:694-8.
4. Bartel F, Taubert H, Harris L. Alternative and aberrant splicing of MDM2mRNA in human cancer. Cancer Cell2002;2:9-15.
Deltagere
- Bård Mannsåker Ph.d.-kandidat
- Stian Knappskog Medveileder
- Per Eystein Lønning Hovedveileder
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til Faglig rapportering, Helse Vest