Autoantistoff som årsak til aterosklerose
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 911993
- Ansvarlig person
- Jan Erik Nordrehaug
- Institusjon
- Helse Stavanger HF
- Prosjektkategori
- Korttidsprosjekt
- Helsekategori
- Cardiovascular
- Forskningsaktivitet
- 2. Aetiology
Rapporter
Formålet var å oppnå immunrespons mot angiotensin II type 1 reseptor (AT1R) i mus for å vurdere effekten av antistoffer mot AT1R på utvikling av aterosklerose og kardiomyopati i mus. C57BL/6 mus ble immunisert med flere peptidbaserte vaksiner i systematisk orden. Det ble oppnådd immunrespons som var for svak til å kunne fortsette studiene.Det er gjennomført to pilotstudier med formål å oppnå en immunrespons mot angiotensin II type 1 reseptor(AT1R) i mus og for å vurdere effekten av antistoffer mot AT1R på utvikling av aterosklerose i mus. Dette ble gjort ved å immunisere C57BL/6-mus med en peptidbasert vaksine bestående av aminosyresekvensen fra den andre ekstracellulære løkken til AT1R. I den første studien brukte vi en kort peptidsekvens tilsvarende til epitopen, som i andre studier har vært funnet til å være det sterkeste bindingsstedet for antistoffer mot AT1R. Det ble ikke oppnådd god nok immunrespons i den første studien og en ny studie ble planlagt.
I den andre studien ble det i tillegg forsøkt med en lengre peptidsekvens pga høyere immunogenisitet, binding av peptidene til et makromolekyl med kjente bindingsseter for T-celler og lengre immuniseringsperiode. Av analyser ble det gjort ”in-house”-ELISA, som vil si at vi dekker brønner med peptidet vi har brukt til immunisering og detekterer grad av IgG-binding fra museplasma. På denne måten kan man si noe om immunrespons mot det eksakte peptidet vi har brukt. I tillegg har vi gjennom samarbeid med CellTrend (verdensledende på deteksjon av antistoffer mot G-protein-koblede reseptorer(GPCR)), kunnet bruke en cellebasert ELISA. Det vil si at man anvender rekombinante reseptorer som er overuttrykt i celler. Deretter ekstraherer man cellemembraner med den native konformasjonen av reseptoren og dekker brønner i platene man skal bruke til å analysere plasma med. Dette gir et mer riktig mål på hvilke antistoffer som faktisk binder seg til reseptoren in vivo.
Resultatene av den andre studien viste at vi hadde oppnådd noe bedre immunrespons enn i den første, men ikke nok til at man kunne starte en større studie. Det ble igangsatt en ny plan for immuniseringsstudie og gjennom dette arbeidet kontaktet flere forskningsgrupper som driver med lignende forskning. Vi deltok også i et oppstartsmøte for anti-GPCR-forskning i Tyskland. Vi fikk her presentert resultater fra flere upubliserte studier som viser at peptidvaksiner er 1) svært avhengig av genotype på forsøksdyr og 2) ikke danner antistoffer med samme egenskaper som finnes hos mennesker in vivo. I løpet av de siste årene har teknologien for å produsere ELISA basert på full-reseptor analyser (cellebasert ELISA), som beholder konformasjonelle epitoper slik som de forekommer in vivo gjort store fremskritt, men fremstilling av vaksiner basert på disse, er fremdeles svært kostbart og utenfor de økonomiske rammene til vårt prosjekt.
På bakgrunn av egne og andres resultater har vi gjort en kostnad-risiko-vurdering mtp å gå videre med peptid-vaksiner, bytte til full-reseptor-vaksiner eller å analysere tilstedeværelse av flere antistoffer mot reseptorer i humant serum. Konklusjonen er at det beste vi kan gjøre med dagens kunnskap, tilgjengelige metoder og analyser er å undersøke effekten av disse antistoffene hos pasienter med iskemisk hjertesvikt fra en tilgjengelig biobank (allerede REK-godkjent studie). Data er ferdig analysert og planlegges publisert våren 2017.
Hjertekarsystemet er i stor grad regulert av GPCR, representert ved sentrale reseptorer i det autonome nervesystemet. Målet med studien var å immunisere mus med for å få produsert autoantistoff mot AT1R for å indusere aterosklerose. Resultatene vil danne grunnlag for å finne aterosklerose markør og for klinisk studie.I opprinnelig protokoll ble det planlagt å gjennomføre en mindre pilot for å etablere at man kunne oppnå immunrespons i aktuelle mus for å kunne gjennomføre selve studien. Det viste seg raskt at opprinnelig plan måtte endres og i første omgang økes i antall for å få nok power til å kunne detektere en forskjell og at nok parametere ble testet. Pilot 1 viste at det var vanskelig å oppnå en god nok immunrespons og de to kontrollmusene vi hadde med som ekstra mus, viste nesten en lik økning i antistoffer mot AT1R, som gruppen som hadde fått sterkest dose med adjuvans og peptid.
Vi konkluderte med at sannsynligvis var det peptidet i seg selv og dets immunogenisitet som var problemet, og dermed ønsket vi å undersøke en lengre peptidsekvens. I tillegg kunne mangel på T-cellerespons være et problem og dermed ønsket vi å undersøke om en konjugering med en kjent T-celle-epitop kunne øke immunresponsen. Pilot 2 ble gjennomført fra juni til september. Piloten og mus var egentlig klar allerede i juni, men pga produksjonsproblemer fra produsenten av immuniseringspeptidet, ble det en ufrivillig forsinkelse av oppstart.
Også i pilot 2 var det lite respons på immuniseringen. Analyser av antistoffrespons i egne peptidbaserte ELISA-analyser, viser lik manglende respons som i cellebaserte ELISA-analyser fra CellTrend. Etter nok en nøye vurdering av gjennomførte piloter, har vi tatt kontakt med andre som har utført nesten tilsvarende studier, samt ytterligere litteratursøk og evaluering av metode. Konklusjonen foreløpig er at det er veldig vanskelig å oppnå en immunrespons mot kroppsegne peptider (selv om de ikke er helt like). Fra andre som har utført lignende studier, har vi fått opplyst om det ser ut til at vi har gjort alt metodisk riktig, men at problemet kan være musetypen. Små endringer i immunologiske molekyler kan ha stort innvirkning på immunrespons og andre har opplevd at bare det å endre produsent av musemodell har gitt resultater. En musemodell med samme navn trenger ikke å være nøyaktig lik mellom forskjellige produsenter.
Antistoffer mot alfa 1 adrenoseptor er fremdeles aktuelt å undersøke, men er nedprioritert til fordel for i første omgang å kunne se på AT1R (mest etablert kunnskap om) og at tidsbruk kanskje ikke strekker til. Vi ønsker også å se på resultater fra antistoff-screening av pasienter med hjertesvikt dersom noen interessante antistoffer skiller seg ut som potensielle kandidater til å undersøke i dyremodeller.
Deltagere
- Lasse Melvær Giil Medveileder
- Jan Erik Nordrehaug Prosjektleder
- Ligun Zhang Prosjektdeltaker
- Anders Lund Ph.d.-kandidat
- Rolf Kristian Berge Medveileder
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til Faglig rapportering, Helse Vest