Evolution and spread of high-level beta-lactam resistance in Haemophilus influenzae

2019: Sekvensering, bioinformatikk, transformasjon og fitness - og vår første publikasjon basert på helgenomdata2019 var et nytt begivenhetsrikt år for prosjektet. De viktigste milepælene var sluttføring av helgenomsekvensering av alle prosjektstammene, etablering av en enkel bioinformatisk pipeline, innkjøp av arbeidsstasjon for avansert bioinformatikk, etablering av laboratoriemetoder for transformasjon og fitnessanalyser - og en internasjonal publikasjon.FORMÅL Formålet med prosjektet er å gi ny kunnskap om mekanismer for utvikling og spredning av antibiotikaresistens hos bakterien Haemophilus influenzae, med vekt på å identifisere og karakterisere suksessfulle (virulente, resistente og utbredte) kloner. Dette vil gi grunnlag for utvikling av globale overvåkingssystemer og innovative strategier for forebygging og behandling av infeksjoner. DELSTUDIE 1 Alle prosjektstammene er ferdig sekvensert, og vi har etablert en enkel bioinformatisk pipeline for stammekarakterisering med MLST og påvisning av kromosomale og overførbare resistensmekanismer. Vi arbeider nå med analysering og sammenstilling av data fra den genetiske analysen og tidligere utført resistensbestemmelse. Deretter vil mikrobiologiske data bli koblet mot kliniske og demografiske data for pasientene som bakterieisolatene er hentet fra. Dette vil gi verdifull informasjon om mønster og mekanismer for spredning av resistente bakteriekloner. På tampen av året fikk vi akseptert et manuskript basert på dypere analyse av overførbare resistensmekanismer hos et utvalg av isolatene. Artikkelen ble publisert i mSphere i januar 2020. DELSTUDIE 2 For første gang har vi utført transformasjon i vårt laboratorium. Dette innebærer at vi har brukt syntetisk DNA til å lage resistente mutanter (transformanter) av en følsom referansestamme. Transformantene er genetisk identiske bortsett fra 1, 2 eller 3 mutasjoner i genet som koder for penicillinbindende protein 3 (PBP3), som er angrepspunktet for betalaktamantibiotika. På denne måten kan vi studere effekten av disse mutasjonene på bakteriens følsomhet for antibiotika og bakteriens vekstegenskaper og konkurranseevne (fitness). Dette gjør oss i stand til å teste en av hovedhypotesene i prosjektet. Ifølge denne hypotesen utvikler Haemophilus influenzae resistens mot betalaktamantibiotika ved trinnvis ervervelse av bestemte PBP3-mutasjoner i en bestemt rekkefølge, og denne prosessen er styrt av fitness. Sagt på en annen måte: Mutasjonene som gir resistens må oppstå i en bestemt rekkefølge for at bakterien skal være levedyktig. For å teste hypotesen etablerte vi to eksperimentelle modeller for sammenligning av fitness. I den ene modellen undersøkte vi transformantenes vekstkinetikk ved å tilsette en liten, standardisert mengde bakterieceller til en næringsrik buljong og deretter inkubere den i ett døgn mens vi målte tettheten i buljongen med jevne mellomrom. Raskt økende tetthet er et tegn på høy fitness. I den andre modellen lot vi to og to transformanter konkurrere om plassen i samme type næringsbuljong og undersøkte om den ene utkonkurrerte den andre over tid. Til dette brukte vi selektive dyrkningsmedier med antibiotikakonsentrasjoner som gjorde det mulig å skille transformantene fra hverandre. Resultatene fra delstudie 2 vil danne utgangspunkt for en masteroppgave for bioingeniør Kanita Pimpaporn ved OsloMet, og deretter for en internasjonal publikasjon. Delstudien har også gitt oss verdifull erfaring med nye eksperimentelle modeller som kan benyttes i fremtidige studier. ANDRE AKTIVITETER - Ansatt bioinformatiker og anskaffet arbeidsstasjon for avansert bioinformatikk - Etablert lokal forskningsgruppe innenfor antibiotikaresistens med ca 10 personer (inkludert 1 PhD-student og 2 masterstudenter) - Spin-off-prosjekter som utgangspunkt for ny tildeling av strategiske forskningsmidler fra HSØ (2 postdoc og 1 nytt masterprosjekt) - Etablert forskningssamarbeid med nye miljøer ved UiO og OsloMet

2018: Åpning av NGS-lab, utførelse av forskningsanalyser og rekruttering av mastergradsstudentDet har vært et begivenhetsrikt år i prosjektet. Etter mye arbeid med søknader, planlegging og etablering av metoder og infrastruktur ble NGS-laben endelig åpnet våren 2018, og vi har produsert betydelige mengder data i Delstudie 1. Parallelt har vi forberedt en pilot til Delstudie 2, som vil bli utført av en mastergradsstudent våren 2019.FORMÅL Formålet med prosjektet er å gi ny kunnskap om mekanismer for utvikling og spredning av antibiotikaresistens hos bakterien Haemophilus influenzae, med vekt på å identifisere og karakterisere suksessfulle (virulente, resistente og utbredte) kloner. Dette vil gi grunnlag for utvikling av globale overvåkingssystemer og innovative strategier for forebygging og behandling av infeksjoner. DELSTUDIE 1 Kriteriet for inklusjon av bakteriestammer er bekreftet resistens mot cefotaksim ved resistensbestemmelse med MIC-metode og følsomhetskategorisering i henhold til europeiske anbefalinger fra EUCAST (www.eucast.org). Cefotaksim er et betalaktamantibiotikum av typen 3. generasjons cefalosporin, som ofte benyttes til empirisk behandling av særlig alvorlige bakterielle infeksjoner. Det vil bli utført helgenomsekvensering av bakterie-DNA for klonalitetsanalyse og kartlegging av resistens- og virulensmarkører, samt resistensbestemmelse med referansemetode. Data fra bakterielle analyser vil bli koblet til metadata og kliniske data for deskriptiv statistisk og epidemiologisk analyse. Oppnådde milepæler i 2018: - Prosjektet er godkjent av REK, NSD og Personvernombudet ved Sykehuset i Vestfold. - Inklusjon av bakterieisolater er fullført. Det endelige stammematerialet omfatter 226 cefotaksimresistente kliniske isolater av Haemophilus influenzae fra norske (n=217) og svenske (n=9) laboratorier mellom 2006 og oktober 2018. Stammematerialet er unikt i europeisk sammenheng. - Resistensbestemmelse med referansemetode (broth milcrodilution MIC) for 21 ulike antibiotika (herunder ni betalaktamer) er utført for samtlige isolater. - Helgenomsekvensering er utført for 100 isolater og én referansestamme. - Orienterende bioinformatiske analyser (MLST) er utført for de første 30 isolatene som ledd i kvalitetskontroll av data og etablering av standardisert arbeidsflyt ("pipeline"). Plan for videre arbeid: - Fullføre helgenomsekvensering av det resterende stammematerialet. - Etablere pipeline for bioinformatiske analyser av sekvenser med fokus på fylogeni, resistens- og virulensdeterminanter. - Formalisere en nasjonal "Study Group" bestående av prosjektmedarbeidere ved primærlaboratoriene for hjelp til innhenting av relevante helse- og personopplysninger knyttet til de inkluderte isolatene. - Analysere og sammenstille data for tolkning og publisering. DELSTUDIE 2 Det er i 2018 rekruttert en mastergradsstudent (Kanita Pimpaporn) som skal utføre en pilotstudie med etablering av metoder for transformering og mutagenese samt modell for fitnesseksperimenter. I mastergradsprosjektet vil det i løpet av våren 2019 bli generert mutanter ved transformering av en referansestamme (Haemophilus influenzae Rd KW20) med DNA fra et klinisk isolat med den mest utbredte resistensgivende PBP3-substitusjonen (N526K). Det vil deretter bli utført fitness-eksperimenter for å belyse sammenhengen mellom PBP3-mediert resistens og fitness (konkurransedyktighet). Metodologien og resultatene fra mastergradsprosjektet vil bli benyttet til en bredere studie av effekten av ulike resistensgivende PBP3-mutasjoner for fitness hos Haemophilus influenzae. Prosjektet vil også belyse betydningen av antibiotika for hvor lett resistensgivende mutasjoner overføres mellom bakteriestammer. Resultatene fra delstudie 2 vil gi ny kunnskap om mekanismene for utvikling av betalaktamresistens hos Haemophilus influenzae og hvilke faktorer som påvirker dette.

Aktiviteter i 2017: Stammeinnsamling, infrastruktur, kompetansebygging, testmateriell, nettverk, søknader og formidlingDet har i 2017 vært fokusert på forberedelser til delprosjekt 1, med innsamling og karakterisering av bakteriestammer, anskaffelse av instrument for helgenomsekvensering, og planlegging av resistensbestemmelse. Parallelt har det vært arbeidet med oppbygging av lokal forskningskompetanse, søknader, veiledning og nettverksaktiviteter.Sentrale aktiviteter i 2017 (delprosjekt 1): 1. Stammemateriale Stammematerialet består av 162 cefotaksimresistente (CTX-R) Haemophilus influenzae fra norske laboratorier (herav ca 10 fra blod). Stammene (inkludert 20 fra SiV) er isolert ved primærlaboratoriene og sendt til SiV for supplerende undersøkelser i henhold til nasjonale/nordiske anbefalinger (www.unn.no/afa, www.nordicast.org). Ved SiV utføres utvidet resistensbestemmelse og svar sendes til primærlaboratoriet. Ved bekreftet CTX-R utføres preliminære molekylære analyser og isolatet inkluderes i studien. Det er etablert stammebank for inkluderte isolater. Antallet CTX-R isolater har økt kraftig de siste årene. I 2017 ble det registrert og undersøkt 51 nye isolater (4 fra SiV) fra 12 ulike laboratorier, mot 30 isolater fra 8 laboratorier i 2016. Grunnet økende forekomst og begrensende midler er studieperioden endret fra 2006-2016 til 2012-2017. Materialet vil bli supplert med CTX-R invasive isolater fra referanselaboratoriet ved FHI. 2. Infrastruktur Prosjektet innebærer kartlegging av bakterienes arvestoff ved helgenomsekvensering (WGS). Dette krever etablering av ny infrastruktur og oppbygging av ny kompetanse ved SiV. HSØ-tildelingen omfatter midler til infrastruktur. I 2017 ble det gjennomført en omfattende anskaffelsesprosess for WGS-instrument, med utarbeidelse av kravspesifikasjon, innhenting av informasjon om aktuelle instrumenter fra leverandører og brukere, og kartlegging av problemstillinger knyttet til datasikkerhet og personvern i samarbeid med IKT og personvernombud. Instrument (IonTorrent S5XL) ble kjøpt i februar 2018 og installeres mars 2018. Parallelt med anskaffelsesprosessen har det foregått kompetansebygging innen WGS og bioinformatikk i form av kurs, møter, kontakt med erfarne brukere og selvstudier. Prosjektleder har deltatt på NordicAST-workshop i Gøteborg, seminar ved FHI og TTA-kurs ved OUS. WGS vil bli utført i 2018 og data analysert mhp resistens, virulens og klonalitet. Bioinformatikkstøtte er tilgjengelig via nettverk og prosjektdeltakere. 3. Resistensbestemmelse Det skal gjøres MIC-bestemmelse med buljongfortynningsmetode for 21 ulike antibiotika (herav ni betalaktamer). Hovedfokus er multiresistens og resistens mot antibiotika for alvorlige infeksjoner. I 2017 ble det designet plateoppsett spesielt for studien. 500 plater (for testing i duplikat) ble bestilt oktober 2017 og leveres i mai 2018. Det er inngått avtale med leverandør om utlån av instrumenter for inokulering og avlesning. Arbeidet vil bli utført av prosjektmedarbeidere ved SiV. 4. Nettverk og kompetanseutvikling Mandatet fra HSØ omfatter styrking av forskningskompetansen ved SiV som strategisk satsingsområde. Sentralt står etablering av tverrfaglig lokalt nettverk (IDEAS: Infection Control/Diagnostics/Epidemiology/Antimicrobial resistance/Stewardship), og deltagelse (styremedlem) i HSØ-finansiert nettverk (www.ous-research.no/amr). Prosjektleder er også hovedveileder for Tore Taksdal Stubhaug som har fått PhD-stipend fra SiV og støtte fra SiV/STHF til prosjekt på karbapenemresistens hos Bacteroides fragilis, og medveileder for mastergradstudent Anja Hannisdal på prosjekt om antibiotikabruk i sykehus. 5. Søknader Søknad til Olav Thon Stiftelsen i samarbeid med FHI, Århus universitetshospital og Lunds Universitet om støtte til PhD-kandidat ble ikke innvilget. 6. Formidling Prosjektet og IDEAS har i 2017 vært presentert på internt forskningsseminar ved SiV og på TTA-workshop.

Høygradig betalaktamresistens hos Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae er en viktig årsak til alvorlige nedre luftveisinfeksjoner (f.eks lungebetennelse og KOLS-forverring) og øre-, bihule- og øyebetennelse. I Norge øker resistens mot bredspektrede cefalosporiner, som brukes til empirisk behandling av alvorlige infeksjoner. Prosjektet belyser årsaker til og omfang av slik resistens.Prosjektet er et samarbeid mellom Sykehuset i Vestfold, Nasjonal kompetansetjeneste for påvisning av antibiotikaresistens (K-res), UIT Norges arktiske universitet, Folkehelseinstituttet og Høgskolen i Sørøst-Norge. I tillegg vil alle norske mikrobiologiske laboratorier bli invitert til deltagelse i en nasjonal studiegruppe. Det skal utføres to delstudier med overordnet målsetting å kartlegge mekanismer for utvikling, spredning og persistens av resistens mot bredspektrede cefalosporiner ("høygradig resistens") hos H. influenzae. I løpet av prosjektperioden (2017-2020) planlegges det omfattende karakterisering av en unik samling av ca 100 høygradig resistente H. influenzae fra norske laboratorier (2006-2016). Karakterisering omfatter bl.a. helgenomsekvensering med påfølgende klonalitetsanalyse og kartlegging av virulens- og resistensgener, samt resistensbestemmelse med referanse- og rutinemetodikk. Resultatene vil sammenholdt med demografiske og kliniske data og dermed gi grunnlag for evaluering av antibiotikabehandling og samsvar mellom in vitro resistensbestemmelse og klinisk effekt. Dette vil gi nyttig kunnskap som kan benyttes til å evaluere og forbedre antibiotikaretningslinjer for empirisk behandling ved alvorlige infeksjoner forårsaket av H. influenzae. Kunnskap om resistente kloner og eventuell samvariasjon mellom resistens og virulens vil kunne identifisere "suksessfulle kloner" og gi verdifull informasjon med tanke på fremtidig utvikling av vaksiner mot H. influenzae. I den andre delstudien vil det bli utført mutagenese- og rekombinasjonseksperimenter med påfølgende fitness-studier for å studere effekten av enkeltmutasjoner i genet som koder for penicillinbindende protein 3 (PBP3) på bakteriens "fitness" (veksthastighet/konkurranseevne) og følsomhet for betalaktamantibiotika. Dette vil bidra til økt forståelse av mekanismene for utvikling av resistens og dermed bidra til utvikling av strategier for hvordan resistensutvikling kan motvirkes. Prosjektet er i oppstartsfase (formell prosjektstart 1.1.2017). Utførte aktiviteter til nå har vært arbeid med anskaffelse/etablering av nødvendig forskningsinfrastruktur (instrument for helgenomsekvensering), regional, nasjonal og internasjonal nettverksbygging, litteraturstudier, innsamling av stammer og preliminær stammekarakterisering med fenotypisk resistensbestemmelse og resistensgenotyping (basert på endringer i PBP3), og planlegging av laboratorieeksperimenter. Prosjektet inngår for øvrig i strategisk satsning på forskning på antibiotikaresistens ved Sykehuset i Vestfold og i Helse Sørøst. Som ledd i denne satsningen etableres det lokale forskningsnettverket VARSEL (Vestfold - Antibiotikaresistens - Rasjonell antibiotikabruk - Smittevern - Epidemiologi - Laboratoriediagnostikk) med overordnet formål "bevaring av virksomme antibiotika". Hensikten med nettverket er å samle lokale aktører ved Sykehuset i Vestfold og bygge et sterkt, tverrfaglig miljø med bred forskningsaktivitet innenfor antibiotikaresistens og relaterte emner, i tråd med nasjonale og regionale strategier for å motvirke utvikling og spredning av resistente bakterier. Planlagte VARSEL-aktiviteter omfatter blant annet årlig forskningsseminar/workshop med presentasjon av pågående forskningsprosjekter, samt en internettportal med nyhetsoppdateringer tilrettelagt for informasjon mot befolkningen.