Evolution and spread of high-level beta-lactam resistance in Haemophilus influenzae

Prosjektnummer: 2016132
Ansvarlig person: Dagfinn Skaare
Institusjon: Sykehuset i Vestfold HF
Prosjektkategori: Forskerstipend
Helsekategori: Infection
Forskningsaktivitet: 1. Underpinning, 4. Detection and Diagnosis

2024

Artikkelskriving, forskningsformidling og utvikling av forskningsmiljøHovedaktiviteten i 2024 var publisering og formidling av forskningsresultater i ulike fora. I tillegg har det vært stor aktivitet i forskningsgruppa, med mange pågående prosjekter og etablering av nye verktøy og metoder, spesielt innenfor bioinformatikk.DELSTUDIE 1 - Cefotaksimresistente Haemophilus influenzae Omfattende molekylærepidemiologisk studie med kartlegging av hele kromosomet (helgenomsekvensering) for en unik samling av 213 Haemophilus influenzae fra Norge og Sverige med resistens mot cefotaksim. Middelet brukes til behandling av alvorlige infeksjoner, og resistens er uvanlig både i Norge og ellers i Europa. Hovedfunnet er at cefotaksimresistente H. influenzae spres klonalt (ved smitte fra person til person) både i Norge og på tvers av landegrenser, inkludert virulente kloner med evne til å gi alvorlig sykdom. Et annet viktig funn er at cefotaksimresistente stammer er sikgnifikant oftere resistente mot andre antibiotika (multiresistente). Utkast til manuskript var ferdig i juni 2024 og har vært til sirkulasjon hos medforfattere. En revidert versjon er nå ferdigstilt og innsending til et internasjonal tidsskrift planlegges innen kort tid. Revisjonen tok lengre tid enn forventet fordi en utvidelse av det nyetablerte verktøyet for slektskapsanalyser basert på helgenomsekvensering (cgMLST) ble publisert på det internasjonale nettstedet for molekylærbiologisk karakterisering av H. influenzae (pubMLST.org). Utvidelsen består i en ny og revolusjonerende tilnærming til tolkning av resultater fra cgMLST, med tildeling av en 13-sifret kode (Life Identification NUmber - LIN). LIN-koden gir en nøyektig genetisk "adresse" som kan sammenlignes på tvers av laboratorier over hele kloden. LIN-koding gir mer presise slektskapsanalyser og revolusjonerer overvåking av H. influenzae, og er særlig nyttig for overvåking av internasjonale multiresistente og virulente kloner. Ved å benytte denne metoden til å analysere data i vår studie vil publikasjonen få betydelig større klinisk nytteverdi og internasjonal relevans. DELSTUDIE 2 - Penicillin-bindende protein 3 (PBP3) og betalaktamresistens Belyser betydning av mutasjoner i PBP3, som er angrepspunktet for cefotaksim og andre betalaktamantibiotika (penicillingruppen). Studien belyser sammenheng mellom mutasjoner og resistens, og sammenheng mellom resistensgivende mutasjoner og vekstegenskaper ("fitness"). Sistnevnte sammenheng er interessant fordi resultater fra delstudie 1 kan tyde på at enkelte mutasjoner som gir resistens også gir et konkurransefortrinn. Studien tar sikte på å avklare om et slikt konkurransefortrinn er relatert til høyere grad av resistens, med mer effektiv seleksjon i nærvær av antibiotika, eller om resistensgivende mutasjoner også gir økt fitness, slik det er beskrevet hos f.eks. pneumokokker. Alle eksperimenter er utført og resultater er analysert og sammenstilt. Arbeidet med manuskriptet pågår og forventes ferdigstilt i løpet av 2025. GENERELT Resultater fra prosjektet ble i 2024 presentert på: - Åpen forskningskveld ved SiV, som er et åpent populærvitenskapelig forum for allmenheten og media (https://www.siv.no/arrangementer/apen-forsknings--og-innovasjonskveld/) - Internasjonal forskningskonferanse i regi av Norwegian Consortium for Microbial Genomics (https://www.ncmg.no/1/1/6/kurs-og-seminar) I tråd med mandatet har prosjektleder også: - Veiledet PhD-kandidat og postdok-stipendiat - Bidratt i øvrige relevante interne og eksterne prosjekter - Videreutviklet forskningsinfrastruktur og bioinformatikk-pipelines i samarbeid med molekylærbiolog og bioinformatiker - Ledet forskningsgruppe (www.siv.no/helsefaglig/forskning-og-innovasjon/antibiotikaresistens-forskningsgruppe) - Deltatt i forskningsutvalg ved SiV - Undervisning og kursing - Representert HSØ som leder i referansegruppen for det nasjonale referanselaboratoriet for antibiotikaresistens i Tromsø (K-res)

Forskningsopphold i utlandet

Nei

2023

Videreutvikling av forskningsaktiviteten + artikkelskrivingHovedfokus i 2023 har vært videreutvikling av forskingsaktiviteten samt publisering av resultater fra delprosjekt 1. Dette tatt lengre tid enn forventet, men et manuskript nærmer seg nå ferdigstilling. Studien dokumenterer internasjonal spredning av virulente, cefotaksimresistente og multiresistente kloner av Haemophilus influenzae.DELSTUDIE 1 Svært omfattende molekylærepidemiologisk studie, basert på en unik samling av cefotaksimresistente H. influenzae (213 isolater fra unike pasienter i Norge og Sverige, 2006-2018). Det er gjort resistensbestemmelse med gullstandardmetode mot et bredt spekter av antibiotika, og helgenomsekvensering med påfølgende bioinformatiske analyser. Analyse av data fokuserer på 1) mekanismer for resistens mot cefotaksim, 2) sammenheng mellom mutasjoner og grad av cefotaksimresistens, 3) samtidig resistens mot andre typer antibiotika (multiresistens), 4) slektskapsanalyser, 5) markører for virulens (evne til å gi sykdom) i ulike slektsgrener, og 6) kliniske og epidemiologiske kjennetegn. Manuskriptet var praktisk talt klart for innsending høsten 2023, men vi valgte å utsette innsendingen fordi et nytt verktøy for slektskapsanalyser ble publisert på det internasjonale nettstedet for molekylærbiologisk karakterisering av H. influenzae (pubMLST.org). Verktøyet (core genome multilocus sequence typing - cgMLST) benytter DNA-sekvenser fra bakteriens kjernegenom (dvs. gener som finnes i alle eksemplarer av arten) til å lage individuelle genetiske profiler med entydige typebetegnelser. Grad av genetisk slektskap kan avgjøres ved å sammenligne profiler (telle hvor mange gener som er ulike). Metoden regnes som en internasjonal gullstandard for slektskapsanalyser av bakterier, men har inntil nå har det ikke vært etablert en standard cgMLST metode for H. influenzae. Publisering av en slik standard metode, sammen med en global database med genomsekvenser fra ca 4500 stammer, gjør det mulig å kartlegge spredning av resistente kloner med høy grad av presisjon (en klon er en gruppe isolater som er så nært beslektet at det kan antas at de har spredd seg fra person til person). Verktøyet vil ha svært stor nytteverdi for nasjonal og internasjonal overvåking av H. influenzae Fordi den publiserte metoden fortsatt er under utvikling er det foreløpig ikke etablert en definert grenseverdi for avgrensning av kloner, noe som begrenser metodens nytteverdi. Vi har derfor i løpet av vinteren 2023/24 utført cgMLST på de 213 stammene i vårt materiale, og benyttet våre epidemiologiske data og resistensdata til å validere en grenseverdi for definisjon av klonale grupper. Deretter anvendte vi den validerte grenseverdien på alle genomene i den globale databasen. Tilnærmingen identifiserte en rekke cefotaksimresistente kloner, hvorav flere var spredd til tre eller flere land over flere år. Majoriteten av klonene var multiresistente og inkluderte invasive isolater (fra blod). Funnene gir ny forståelse av omfang og mekanismer for internasjonal spredning av H. influenzae, og kan bl.a få betydning for anbefalte smitteverntiltak ved påvisning av cefotaksim- og multiresistente stammer. Funnene er også relevante for arbeidet med utvikling av nye vaksiner. DELSTUDIE 2 Se rapport for 2022. Arbeidet med manuskriptet vil bli gjenopptatt når manuskript fra delstudie 1 er ferdigstilt. GENERELT I tråd med mandatet har prosjektleder også: - Veiledet PhD-kandidat og postdok-stipendiat - Bidratt i øvrige interne og eksterne prosjekter - Videreutviklet forskningsinfrastruktur og bioinformatikk-pipelines i samarbeid med molekylærbiolog og bioinformatiker - Administrert forskningsgruppe og nettside (www.siv.no/helsefaglig/forskning-og-innovasjon/antibiotikaresistens-forskningsgruppe) - Deltatt i forskningsutvalg - Undervisning og kursing - Rapportert til forskningsledelse SiV/HSØ

Forskningsopphold i utlandet

NEI

2022

2022: Publisering av resultater & styrking av forskningsmiljøAktiviteter siden forrige rapport gjenspeiler det todelte mandatet fra HSØ: Gjennomføring av et spesifikt forskningsprosjekt (antibiotikaresistens hos H. influenzae) og styrking av forskningskompetanse og -infrastruktur. Hovedfokus har vært publisering av resultater og videreutvikling av forskningsmiljøet som er bygd opp rundt prosjektet.DELSTUDIE 1 - Cefotaksimresistente H. influenzae i Norge 2006-2018 Basert på verdens største samling av cefotaksimresistente H. influenzae. Genomsekvenser (n=222) publisert i Genbank mars 2022: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJEB49398 Materialet omfatter bakterieisolater fra samme pasient på ulike tidspunkt. Gir en unik mulighet til å studere in vivo utvikling av resistens ved eksponering for antibiotika. La grunnlag for publikasjon som beskriver utvikling av multiresistent H. influenzae-stamme hos pasient med immunsvikt og tilbakevendende luftveisinfeksjon. Sekvensering av tre isolater over en treårsperiode viste at stammen ikke bare overlevde flere antibiotikabehandlinger, men også tilegnet seg mutasjoner som ga resistens mot flere antibiotika. Publikasjonen er den første som dokumenterer utvikling av resistens hos H. influenzae i pasienten under pågående antibiotikabehandling (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35719354) Ytterligere ett manuskript basert på helgenomsekvenser, resistensbestemmelse og kliniske data for 213 cefotaksimresistente isolater fra unike pasienter forventes publisert i 2023. DELSTUDIE 2 - Penicillin-bindende protein 3 (PBP3) og betalaktamresistens Belyser betydning av mutasjoner i PBP3, som er angrepspunktet for betalaktamer (f.eks penicillin og cefotaksim). Studien er unik ved at den både viser sammenheng mellom mutasjoner og resistens, og sammenheng mellom resistensgivende mutasjoner og vekstegenskaper ("fitness"). Eksperimentene ble gjennomført i 2019-2020, men analysering av data avdekket behov for tilleggseksperimenter som ble utført i 2022. Manuskriptet forventes ferdigstilt i løpet av 2023. STYRKING AV FORSKNINGSMILJØ Siden oppstart i 2017 har det skjedd en betydelig utvikling av forskningsmiljøet ved avdelingen mht kompetanse, infrastruktur, organisering og aktivitet. Milepæler siden forrige rapport: - Formalisering av Forskningsgruppe Antibiotikaresistens med egne nettsider (https://www.siv.no/helsefaglig/forskning-og-innovasjon/antibiotikaresistens-forskningsgruppe). Viktig for identitetsutvikling og synlighet internt og eksternt. Gruppen har 12 medlemmer (herav 5 med PhD, 1 PhD-student, og 1 brukerrepresentant) og har jevnlige møter. Fire publikasjoner med første- og/eller sisteforfatter i 2022. Gruppeleder (DS) har jevnlige møter med klinikkledelse og er medlem av forskningsutvalget - Tildeling av HSØ forskningsmidler til postdoc-prosjekt om antibiotikaresistens hos H. influenzae (prosjekt 2022055) - Anskaffelse av instrument for helgenomsekvensering med "long read" teknologi (MinION). Supplement til vår hovedplattform for gensekvensering (Ion Torrent). Gir komplette genomer og bedre fremstilling av genetiske elementer assosiert med antibiotikaresistens. Benyttes i pågående PhD- (2019037) og postdoc-prosjekter (2020107) - Anskaffelse av instrument for vekstanalyser (plateleser). Benyttet i Delprosjekt 2 og annet postdoc-prosjekt (2020107) - Anskaffelse av SeqSphere+ bioinformatikkprogramvare for kjernegenombaserte slektskapsanalyser (cgMLST). Gjør det mulig å utføre svært presise slektskapsanalyser som kan sammenlignes på tvers av laboratorier ved hjelp av genprofiler basert på unike sekvensvarianter i tusenvis av gener. Benyttet i publikasjonen fra Delstudie 1 og i manuskriptet som er under utarbeidelse - Samarbeid med Folkehelseinstituttet resulterte i publikasjon om invasiv sykdom med H. influenzae i Norge (https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.973257/full)

Forskningsopphold i utlandet

Nei

2020

2020: Videreutvikling av bioinformatikk, analysering av data og publisering av resultaterProsjektet nærmer seg avslutning. Hovedfokus i 2020 har vært 1) videreutvikling av bioinformatikkplattform i retning av standardisering, mer avanserte analyser og større kapasitet, 2) sammenstilling, tolkning og publisering av data fra de to delstudiene, og 3) kompetanseheving, anskaffelse av ny forskningsinfrastruktur, og nettverksbygging.FORMÅL Fremskaffe ny kunnskap om mekanismer for utvikling og spredning av antibiotikaresistens hos bakterien Haemophilus influenzae, som er en viktig årsak til luftveisinfeksjoner og antibiotikabruk. DELSTUDIE 1 Molekylærepidemiologisk studie av 219 cefotaksimresistente isolater fra Norge (n=211) og Sverige (n=8) i perioden 2006-2018. Datamaterialet omfatter DNA-sekvenser (helgenomsekvensering), resistensbestemmelse for 21 ulike antibiotika, og metadata med opplysninger om når, hvor og hvordan prøven er tatt. Bioinformatiske analyser av DNA inkluderer slektskapsanalyser, påvisning av overførbare resistensgener og mutasjoner i kromosomale gener som er assosiert med resistens, og påvisning av gener som er assosiert med økt evne til å gi sykdom (virulens). Resultatene gjør det mulig å kartlegge utbredelsen av resistente og virulente kloner og slik danne grunnlag for nye overvåkingssystemer nasjonalt og globalt, utvikling av nye vaksiner, og kvalitetssikring/oppdatering av retningslinjer for antibiotikabehandling. Delstudie 1 har mottatt forskningsmidler fra NORM til inkludering av cefotaksimresistente invasive stammer (fra blod eller spinalvæske) fra FHI, som er nasjonalt referanselaboratorium for invasive H. influenzae. En rapport med foreløpige analyser av disse isolatene er sendt til NORM og FHI som ledd i løpende kvalitetssikring av nasjonale overvåkingssystemer og referansefunksjoner. Samarbeidet med FHI om Delstudie 1 har lagt grunnlaget for et nytt planlagt forskningssamarbeid om antibiotikaresistens, virulens og klonalitet hos invasive H. influenzae i Norge. DELSTUDIE 2 Eksperimentell laboratoriestudie hvor vi har generert resistente mutanter ved transformasjon (opptak av fritt DNA) og testet effekten av resistensgivende mutasjoner på bakteriell fitness (veksthastighet og konkurranseevne). Tilsvarende eksperimenter er ikke tidligere gjort på H. influenzae. Resultatene vil gi ny kunnskap om hvilke mekanismer som styrer resistensutvikling og hvordan dette kan forhindres og reverseres. PUBLISERING Datainnsamling og analysering av data er i praksis fullført i begge delprosjekter. To manuskripter for publisering i internasjonalt tidsskrift er under utarbeidelse og forventes ferdigstilt i løpet av våren. ANDRE MILEPÆLER - I februar ble forskningsgruppen utvidet med bioinformatiker Nermin Zecic fra OUS. Dette gjorde at vi kunne ta i bruk nyanskaffet arbeidsstasjon for avansert/storvolum bioinformatikk. Mye av året har gått med til oppbygging og validering av bioinformatisk analysepipeline med utgangspunkt i data fra helgenomsekvensering av stammematerialet i Delstudie 1. - I august ble det avsatt investeringsmidler ved SiV til anskaffelse av pipetteringsrobot for automatisering av resistensbestemmelse av bakterier med referansemetode (buljongfortynning MIC). Instrumentet er helt essensiell infrastruktur ved forskning på antibiotikaresistens og gjør det mulig å utføre gullstandard forskningsanalyser ved eget laboratorium. - I desember fullførte prosjektmedarbeider Kanita Pimpaporn sin mastergrad ved OsloMet med toppkarakter. - I desember ble det også levert søknad om formell godkjenning av vår forskningsgruppe ("Antibiotikaresistens") ved SiV. Søknaden omfatter også midler til anskaffelse av instrument for helgenomsekvensering med tredjegenerasjonsteknologi. Kombinert med allerede etablert plattform for nestegenerasjonssekvensering vil dette gjøre det mulig å rekonstruere komplette genomer av høy kvalitet ved eget laboratorium.

Forskningsopphold i utlandet

NEI

2019

2019: Sekvensering, bioinformatikk, transformasjon og fitness - og vår første publikasjon basert på helgenomdata2019 var et nytt begivenhetsrikt år for prosjektet. De viktigste milepælene var sluttføring av helgenomsekvensering av alle prosjektstammene, etablering av en enkel bioinformatisk pipeline, innkjøp av arbeidsstasjon for avansert bioinformatikk, etablering av laboratoriemetoder for transformasjon og fitnessanalyser - og en internasjonal publikasjon.FORMÅL Formålet med prosjektet er å gi ny kunnskap om mekanismer for utvikling og spredning av antibiotikaresistens hos bakterien Haemophilus influenzae, med vekt på å identifisere og karakterisere suksessfulle (virulente, resistente og utbredte) kloner. Dette vil gi grunnlag for utvikling av globale overvåkingssystemer og innovative strategier for forebygging og behandling av infeksjoner. DELSTUDIE 1 Alle prosjektstammene er ferdig sekvensert, og vi har etablert en enkel bioinformatisk pipeline for stammekarakterisering med MLST og påvisning av kromosomale og overførbare resistensmekanismer. Vi arbeider nå med analysering og sammenstilling av data fra den genetiske analysen og tidligere utført resistensbestemmelse. Deretter vil mikrobiologiske data bli koblet mot kliniske og demografiske data for pasientene som bakterieisolatene er hentet fra. Dette vil gi verdifull informasjon om mønster og mekanismer for spredning av resistente bakteriekloner. På tampen av året fikk vi akseptert et manuskript basert på dypere analyse av overførbare resistensmekanismer hos et utvalg av isolatene. Artikkelen ble publisert i mSphere i januar 2020. DELSTUDIE 2 For første gang har vi utført transformasjon i vårt laboratorium. Dette innebærer at vi har brukt syntetisk DNA til å lage resistente mutanter (transformanter) av en følsom referansestamme. Transformantene er genetisk identiske bortsett fra 1, 2 eller 3 mutasjoner i genet som koder for penicillinbindende protein 3 (PBP3), som er angrepspunktet for betalaktamantibiotika. På denne måten kan vi studere effekten av disse mutasjonene på bakteriens følsomhet for antibiotika og bakteriens vekstegenskaper og konkurranseevne (fitness). Dette gjør oss i stand til å teste en av hovedhypotesene i prosjektet. Ifølge denne hypotesen utvikler Haemophilus influenzae resistens mot betalaktamantibiotika ved trinnvis ervervelse av bestemte PBP3-mutasjoner i en bestemt rekkefølge, og denne prosessen er styrt av fitness. Sagt på en annen måte: Mutasjonene som gir resistens må oppstå i en bestemt rekkefølge for at bakterien skal være levedyktig. For å teste hypotesen etablerte vi to eksperimentelle modeller for sammenligning av fitness. I den ene modellen undersøkte vi transformantenes vekstkinetikk ved å tilsette en liten, standardisert mengde bakterieceller til en næringsrik buljong og deretter inkubere den i ett døgn mens vi målte tettheten i buljongen med jevne mellomrom. Raskt økende tetthet er et tegn på høy fitness. I den andre modellen lot vi to og to transformanter konkurrere om plassen i samme type næringsbuljong og undersøkte om den ene utkonkurrerte den andre over tid. Til dette brukte vi selektive dyrkningsmedier med antibiotikakonsentrasjoner som gjorde det mulig å skille transformantene fra hverandre. Resultatene fra delstudie 2 vil danne utgangspunkt for en masteroppgave for bioingeniør Kanita Pimpaporn ved OsloMet, og deretter for en internasjonal publikasjon. Delstudien har også gitt oss verdifull erfaring med nye eksperimentelle modeller som kan benyttes i fremtidige studier. ANDRE AKTIVITETER - Ansatt bioinformatiker og anskaffet arbeidsstasjon for avansert bioinformatikk - Etablert lokal forskningsgruppe innenfor antibiotikaresistens med ca 10 personer (inkludert 1 PhD-student og 2 masterstudenter) - Spin-off-prosjekter som utgangspunkt for ny tildeling av strategiske forskningsmidler fra HSØ (2 postdoc og 1 nytt masterprosjekt) - Etablert forskningssamarbeid med nye miljøer ved UiO og OsloMet

Forskningsopphold i utlandet

Nei

2018

2018: Åpning av NGS-lab, utførelse av forskningsanalyser og rekruttering av mastergradsstudentDet har vært et begivenhetsrikt år i prosjektet. Etter mye arbeid med søknader, planlegging og etablering av metoder og infrastruktur ble NGS-laben endelig åpnet våren 2018, og vi har produsert betydelige mengder data i Delstudie 1. Parallelt har vi forberedt en pilot til Delstudie 2, som vil bli utført av en mastergradsstudent våren 2019.FORMÅL Formålet med prosjektet er å gi ny kunnskap om mekanismer for utvikling og spredning av antibiotikaresistens hos bakterien Haemophilus influenzae, med vekt på å identifisere og karakterisere suksessfulle (virulente, resistente og utbredte) kloner. Dette vil gi grunnlag for utvikling av globale overvåkingssystemer og innovative strategier for forebygging og behandling av infeksjoner. DELSTUDIE 1 Kriteriet for inklusjon av bakteriestammer er bekreftet resistens mot cefotaksim ved resistensbestemmelse med MIC-metode og følsomhetskategorisering i henhold til europeiske anbefalinger fra EUCAST (www.eucast.org). Cefotaksim er et betalaktamantibiotikum av typen 3. generasjons cefalosporin, som ofte benyttes til empirisk behandling av særlig alvorlige bakterielle infeksjoner. Det vil bli utført helgenomsekvensering av bakterie-DNA for klonalitetsanalyse og kartlegging av resistens- og virulensmarkører, samt resistensbestemmelse med referansemetode. Data fra bakterielle analyser vil bli koblet til metadata og kliniske data for deskriptiv statistisk og epidemiologisk analyse. Oppnådde milepæler i 2018: - Prosjektet er godkjent av REK, NSD og Personvernombudet ved Sykehuset i Vestfold. - Inklusjon av bakterieisolater er fullført. Det endelige stammematerialet omfatter 226 cefotaksimresistente kliniske isolater av Haemophilus influenzae fra norske (n=217) og svenske (n=9) laboratorier mellom 2006 og oktober 2018. Stammematerialet er unikt i europeisk sammenheng. - Resistensbestemmelse med referansemetode (broth milcrodilution MIC) for 21 ulike antibiotika (herunder ni betalaktamer) er utført for samtlige isolater. - Helgenomsekvensering er utført for 100 isolater og én referansestamme. - Orienterende bioinformatiske analyser (MLST) er utført for de første 30 isolatene som ledd i kvalitetskontroll av data og etablering av standardisert arbeidsflyt ("pipeline"). Plan for videre arbeid: - Fullføre helgenomsekvensering av det resterende stammematerialet. - Etablere pipeline for bioinformatiske analyser av sekvenser med fokus på fylogeni, resistens- og virulensdeterminanter. - Formalisere en nasjonal "Study Group" bestående av prosjektmedarbeidere ved primærlaboratoriene for hjelp til innhenting av relevante helse- og personopplysninger knyttet til de inkluderte isolatene. - Analysere og sammenstille data for tolkning og publisering. DELSTUDIE 2 Det er i 2018 rekruttert en mastergradsstudent (Kanita Pimpaporn) som skal utføre en pilotstudie med etablering av metoder for transformering og mutagenese samt modell for fitnesseksperimenter. I mastergradsprosjektet vil det i løpet av våren 2019 bli generert mutanter ved transformering av en referansestamme (Haemophilus influenzae Rd KW20) med DNA fra et klinisk isolat med den mest utbredte resistensgivende PBP3-substitusjonen (N526K). Det vil deretter bli utført fitness-eksperimenter for å belyse sammenhengen mellom PBP3-mediert resistens og fitness (konkurransedyktighet). Metodologien og resultatene fra mastergradsprosjektet vil bli benyttet til en bredere studie av effekten av ulike resistensgivende PBP3-mutasjoner for fitness hos Haemophilus influenzae. Prosjektet vil også belyse betydningen av antibiotika for hvor lett resistensgivende mutasjoner overføres mellom bakteriestammer. Resultatene fra delstudie 2 vil gi ny kunnskap om mekanismene for utvikling av betalaktamresistens hos Haemophilus influenzae og hvilke faktorer som påvirker dette.

Forskningsopphold i utlandet

NEI

2017

Aktiviteter i 2017: Stammeinnsamling, infrastruktur, kompetansebygging, testmateriell, nettverk, søknader og formidlingDet har i 2017 vært fokusert på forberedelser til delprosjekt 1, med innsamling og karakterisering av bakteriestammer, anskaffelse av instrument for helgenomsekvensering, og planlegging av resistensbestemmelse. Parallelt har det vært arbeidet med oppbygging av lokal forskningskompetanse, søknader, veiledning og nettverksaktiviteter.Sentrale aktiviteter i 2017 (delprosjekt 1): 1. Stammemateriale Stammematerialet består av 162 cefotaksimresistente (CTX-R) Haemophilus influenzae fra norske laboratorier (herav ca 10 fra blod). Stammene (inkludert 20 fra SiV) er isolert ved primærlaboratoriene og sendt til SiV for supplerende undersøkelser i henhold til nasjonale/nordiske anbefalinger (www.unn.no/afa, www.nordicast.org). Ved SiV utføres utvidet resistensbestemmelse og svar sendes til primærlaboratoriet. Ved bekreftet CTX-R utføres preliminære molekylære analyser og isolatet inkluderes i studien. Det er etablert stammebank for inkluderte isolater. Antallet CTX-R isolater har økt kraftig de siste årene. I 2017 ble det registrert og undersøkt 51 nye isolater (4 fra SiV) fra 12 ulike laboratorier, mot 30 isolater fra 8 laboratorier i 2016. Grunnet økende forekomst og begrensende midler er studieperioden endret fra 2006-2016 til 2012-2017. Materialet vil bli supplert med CTX-R invasive isolater fra referanselaboratoriet ved FHI. 2. Infrastruktur Prosjektet innebærer kartlegging av bakterienes arvestoff ved helgenomsekvensering (WGS). Dette krever etablering av ny infrastruktur og oppbygging av ny kompetanse ved SiV. HSØ-tildelingen omfatter midler til infrastruktur. I 2017 ble det gjennomført en omfattende anskaffelsesprosess for WGS-instrument, med utarbeidelse av kravspesifikasjon, innhenting av informasjon om aktuelle instrumenter fra leverandører og brukere, og kartlegging av problemstillinger knyttet til datasikkerhet og personvern i samarbeid med IKT og personvernombud. Instrument (IonTorrent S5XL) ble kjøpt i februar 2018 og installeres mars 2018. Parallelt med anskaffelsesprosessen har det foregått kompetansebygging innen WGS og bioinformatikk i form av kurs, møter, kontakt med erfarne brukere og selvstudier. Prosjektleder har deltatt på NordicAST-workshop i Gøteborg, seminar ved FHI og TTA-kurs ved OUS. WGS vil bli utført i 2018 og data analysert mhp resistens, virulens og klonalitet. Bioinformatikkstøtte er tilgjengelig via nettverk og prosjektdeltakere. 3. Resistensbestemmelse Det skal gjøres MIC-bestemmelse med buljongfortynningsmetode for 21 ulike antibiotika (herav ni betalaktamer). Hovedfokus er multiresistens og resistens mot antibiotika for alvorlige infeksjoner. I 2017 ble det designet plateoppsett spesielt for studien. 500 plater (for testing i duplikat) ble bestilt oktober 2017 og leveres i mai 2018. Det er inngått avtale med leverandør om utlån av instrumenter for inokulering og avlesning. Arbeidet vil bli utført av prosjektmedarbeidere ved SiV. 4. Nettverk og kompetanseutvikling Mandatet fra HSØ omfatter styrking av forskningskompetansen ved SiV som strategisk satsingsområde. Sentralt står etablering av tverrfaglig lokalt nettverk (IDEAS: Infection Control/Diagnostics/Epidemiology/Antimicrobial resistance/Stewardship), og deltagelse (styremedlem) i HSØ-finansiert nettverk (www.ous-research.no/amr). Prosjektleder er også hovedveileder for Tore Taksdal Stubhaug som har fått PhD-stipend fra SiV og støtte fra SiV/STHF til prosjekt på karbapenemresistens hos Bacteroides fragilis, og medveileder for mastergradstudent Anja Hannisdal på prosjekt om antibiotikabruk i sykehus. 5. Søknader Søknad til Olav Thon Stiftelsen i samarbeid med FHI, Århus universitetshospital og Lunds Universitet om støtte til PhD-kandidat ble ikke innvilget. 6. Formidling Prosjektet og IDEAS har i 2017 vært presentert på internt forskningsseminar ved SiV og på TTA-workshop.

2016

Høygradig betalaktamresistens hos Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae er en viktig årsak til alvorlige nedre luftveisinfeksjoner (f.eks lungebetennelse og KOLS-forverring) og øre-, bihule- og øyebetennelse. I Norge øker resistens mot bredspektrede cefalosporiner, som brukes til empirisk behandling av alvorlige infeksjoner. Prosjektet belyser årsaker til og omfang av slik resistens.Prosjektet er et samarbeid mellom Sykehuset i Vestfold, Nasjonal kompetansetjeneste for påvisning av antibiotikaresistens (K-res), UIT Norges arktiske universitet, Folkehelseinstituttet og Høgskolen i Sørøst-Norge. I tillegg vil alle norske mikrobiologiske laboratorier bli invitert til deltagelse i en nasjonal studiegruppe. Det skal utføres to delstudier med overordnet målsetting å kartlegge mekanismer for utvikling, spredning og persistens av resistens mot bredspektrede cefalosporiner ("høygradig resistens") hos H. influenzae. I løpet av prosjektperioden (2017-2020) planlegges det omfattende karakterisering av en unik samling av ca 100 høygradig resistente H. influenzae fra norske laboratorier (2006-2016). Karakterisering omfatter bl.a. helgenomsekvensering med påfølgende klonalitetsanalyse og kartlegging av virulens- og resistensgener, samt resistensbestemmelse med referanse- og rutinemetodikk. Resultatene vil sammenholdt med demografiske og kliniske data og dermed gi grunnlag for evaluering av antibiotikabehandling og samsvar mellom in vitro resistensbestemmelse og klinisk effekt. Dette vil gi nyttig kunnskap som kan benyttes til å evaluere og forbedre antibiotikaretningslinjer for empirisk behandling ved alvorlige infeksjoner forårsaket av H. influenzae. Kunnskap om resistente kloner og eventuell samvariasjon mellom resistens og virulens vil kunne identifisere "suksessfulle kloner" og gi verdifull informasjon med tanke på fremtidig utvikling av vaksiner mot H. influenzae. I den andre delstudien vil det bli utført mutagenese- og rekombinasjonseksperimenter med påfølgende fitness-studier for å studere effekten av enkeltmutasjoner i genet som koder for penicillinbindende protein 3 (PBP3) på bakteriens "fitness" (veksthastighet/konkurranseevne) og følsomhet for betalaktamantibiotika. Dette vil bidra til økt forståelse av mekanismene for utvikling av resistens og dermed bidra til utvikling av strategier for hvordan resistensutvikling kan motvirkes. Prosjektet er i oppstartsfase (formell prosjektstart 1.1.2017). Utførte aktiviteter til nå har vært arbeid med anskaffelse/etablering av nødvendig forskningsinfrastruktur (instrument for helgenomsekvensering), regional, nasjonal og internasjonal nettverksbygging, litteraturstudier, innsamling av stammer og preliminær stammekarakterisering med fenotypisk resistensbestemmelse og resistensgenotyping (basert på endringer i PBP3), og planlegging av laboratorieeksperimenter. Prosjektet inngår for øvrig i strategisk satsning på forskning på antibiotikaresistens ved Sykehuset i Vestfold og i Helse Sørøst. Som ledd i denne satsningen etableres det lokale forskningsnettverket VARSEL (Vestfold - Antibiotikaresistens - Rasjonell antibiotikabruk - Smittevern - Epidemiologi - Laboratoriediagnostikk) med overordnet formål "bevaring av virksomme antibiotika". Hensikten med nettverket er å samle lokale aktører ved Sykehuset i Vestfold og bygge et sterkt, tverrfaglig miljø med bred forskningsaktivitet innenfor antibiotikaresistens og relaterte emner, i tråd med nasjonale og regionale strategier for å motvirke utvikling og spredning av resistente bakterier. Planlagte VARSEL-aktiviteter omfatter blant annet årlig forskningsseminar/workshop med presentasjon av pågående forskningsprosjekter, samt en internettportal med nyhetsoppdateringer tilrettelagt for informasjon mot befolkningen.

Vitenskapelige artikler

Lindemann PC, Mylvaganam H, Oppegaard O, Anthonisen Il, Zecic N, Skaare D

Case Report: Whole-Genome Sequencing of Serially Collected

Front Cell Infect Microbiol 2022;12():896823. Epub 2022 jun 1

PMID: 35719354

Tønnessen R, García I, Debech N, Lindstrøm JC, Wester AL, Skaare D

Molecular epidemiology and antibiotic resistance profiles of invasive

Front Microbiol 2022;13():973257. Epub 2022 aug 29

PMID: 36106084

Skaare D

Tidsskr Nor Laegeforen 2017 Mar;137(6):471. Epub 2017 mar 21

PMID: 28332810

Månsson V, Skaare D, Riesbeck K, Resman F

The spread and clinical impact of ST14CC-PBP3 type IIb/A, a clonal group of non-typeable Haemophilus influenzae with chromosomally mediated β-lactam resistance-a prospective observational study.

Clin Microbiol Infect 2017 Mar;23(3):209.e1-209.e7. Epub 2016 nov 13

PMID: 27852000

Hegstad K, Mylvaganam H, Janice J, Josefsen E, Sivertsen A, Skaare D

Role of Horizontal Gene Transfer in the Development of Multidrug Resistance in Haemophilus influenzae

mSphere, 2020. DOI: 10.1128/mSphere.00969-19

Deltagere

Zecic Nermin Prosjektdeltaker
Kanita Pimpaporn Prosjektdeltaker
Andrew Jenkins Prosjektdeltaker
Arnfinn Sundsfjord Prosjektdeltaker
Pål Jarle Johnsen Prosjektdeltaker
Ørjan Samuelsen Prosjektdeltaker
Kristin Hegstad Prosjektdeltaker
Martin Steinbakk Prosjektdeltaker
Dominique A Caugant Prosjektdeltaker
Inger Lill Anthonisen Prosjektdeltaker
Mette Lundstrøm Dahl Prosjektdeltaker
Anja Hannisdal Prosjektdeltaker
Astrid Lia Prosjektdeltaker
Anita Bratfoss Andreassen Prosjektdeltaker
Dagfinn Skaare Postdoktorstipendiat (finansiert av denne bevilgning)

eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT

Alle henvendelser rettes til eRapport

Personvern - Informasjonskapsler