Karbapenemresistens hos Bacteroides fragilis

Lappediffusjon, bioinformatikk og farmakodynamikkDataene fra den nordiske metodestudien for resistensbestemmelse er analysert, og har gitt ny informasjon om påvisning av antibiotikaresistens hos Bacteroides fragilis. Vi har kommet videre med helgenomsekvensering av bakteriestammer og bioinformatikkanalyser. Planleggingen av den farmakodynamiske studien i delprosjekt 3 har kommet langt.FORMÅL Bacteroides fragilis er en anaerob bakterie, det vil si at den vokser i fravær av oksygen. Bakterien inngår i menneskets normale tarmflora, og kan gi infeksjoner som for eksempel sårinfeksjoner etter kirurgi, abscesser i indre organer og sepsis (blodforgiftning). Prosjektets formål er å undersøke mekanismer som gjør at B. fragilis blir resistent mot antibiotika i gruppen karbapenemer, som brukes til behandling av alvorlige infeksjoner i sykehus. De samme mekanismene gir også resistens mot piperacillin-tazobactam, et antibiotikum som brukes hyppig ved f.eks. postoperative infeksjoner. Vi ser på forekomst og spredning av gener som bidrar til resistens mot disse midlene, hvordan varierende uttrykk av genene påvirker resistens, og hvordan man med nye metoder enklest kan påvise disse resistensmekanismene i mikrobiologiske laboratorier. DELPROSJEKT 1 45 nordiske laboratorier har prøvd ut en metode for å påvise antibiotikaresistens hos Bacterodies fragilis med lappediffusjon. Denne metoden har ikke tidligere vært standardisert for bruk på anaerobe bakterier. Doktorgradskandidaten satte sammen en stammesamling på 30 stammer som ble karakterisert med referansemetodikk. Disse ble testet med lappediffusjon av de 45 deltakende laboratoriene, som rapporterte sine funn. Vi er nå ferdige med å analysere dataene, og har et manuskript som snart er klart til publikasjon. Vi har gjort flere interessante funn, blant annet knyttet til hvilke feilkilder som er viktigst for resistensbestemmelse mhp. ulike antibiotika, hvor godt reproduserbare resultatene er på tvers av laboratorier, og i hvilken grad resultatene ved lappediffusjon kan brukes til å predikere tilstedeværelse av resistensgener. DELPROSJEKT 2 Dette delprosjektet omfatter stammer av Bacteroides fragilis som er dyrket fra blod i en tiårsperiode, hos pasienter som har hatt blodbaneinfeksjoner med B. fragilis i Vestfold, Telemark og Oslo Målet med prosjektet er å kartlegge slektskapsforhold mellom bakteriene og endring over tid i forekomsten av genetiske elementer som har betydning for antibiotikaresistens. I 2020 har vi utført helgenomsekvensering av ytterligere stammer, og har nå sekvensert totalt 146 stammer. Stammene er undersøkt for forekomsten av antibiotikaresistensgener og flyttbare genetiske elementer. Doktorgradskandidaten har deltatt på et 5-ukers kurs i bioinformatikk, og avdelingens bioinformatiker har også arbeidet med å forbedre de bioinformatiske analysene til å kunne hente ut ytterligere informasjon fra helgenomdataene. DELPROSJEKT 3 Målet med delprosjektet er å undersøke om tilstedeværelse av cfiA-genet påvirker effekten av antibiotikabehandling på måter som ikke fanges opp ved vanlig resistensbestemmelse, samt om cfiA-bærende stammer er spesielt utsatt for seleksjon av resistente mutanter under antibiotikabehandling. Vi har utarbeidet en protokoll for farmakodynamiske ekperimenter som kan kartlegge i detalj hvor effektive antibiotika er mot B. fragilis med ulike resistensrelaterte gener. Doktorgradskandidaten vil utføre disse på stammer som er nøye karakterisert under delprosjekt 1. I forbindelse med inkludering av bakteriestammer til dette delprosjektet har vi også oppdaget et mobilt genetisk element som ser ut til å være assosiert med karbapenemresistens hos B. fragilis. Vi arbeider med å karakterisere dette genelementet nøyere.

2019: Nordisk metodestudie gjennomførtI 2019 har prosjektets hovedaktiviteter vært knyttet til delprosjekt 1, der 45 nordiske laboratorier har deltatt i utprøving av en ny metode for resistensbestemmelse av anaerobe bakterier. Det har også foregått aktivitet knyttet til de andre delprosjektene.Bacteroides fragilis er en anaerob bakterie, det vil si at den vokser i fravær av oksygen. Bakterien inngår i menneskets normale tarmflora, og kan gi infeksjoner som for eksempel sårinfeksjoner etter kirurgi, abscesser i indre organer og sepsis (blodforgiftning). B. fragilis er også den anaerobe bakterien som oftest har resistens mot antibiotika. Prosjektet retter seg hovedsakelig mot B. fragilis som bærer genet cfiA, som kan gi resistens mot de viktige midlene meropenem og piperacillin/tazobactam. Genet kan ha varierende uttrykk, slik at tilstedeværelse av genet ikke nødvendigvis innebærer at bakterien er resistent. DELPROSJEKT 1: Utprøving av ny lappediffusjonsmetode for Bacteroides fragilis En vanlig metode for å påvise antibiotikaresistens hos bakterier er lappediffusjon, der man måler hvor mye bakterieveksten hemmes rundt lapper tilsatt antibiotika. Denne metoden er foreløpig ikke etablert for anaerobe bakterier. Målet med delprosjektet er å prøve ut en lappediffusjonsmetode som er utviklet for Bacteroides fragilis ved EUCAST Development Laboratory i Sverige, samt å vurdere hvordan lappediffusjon fanger opp tilstedeværelse og uttrykk av cfiA-genet. Doktorgradskandidaten har etablert en stammesamling som er karakterisert ved hjelp av følgende metoder: - Resistensbestemmelse for midlene meropenem, piperacillin/tazobactam, klindamycin og metronidazol ved hjelp av referansemetode (agarfortynning) - Påvisning av cfiA-genet ved polymerasekjedereaksjon (PCR) - Målt i hvilken grad stammene uttrykker cfiA-genet ved bruk av kvantitativ revers transkriptase-PCR (qRT-PCR) - Påvisning av andre antibiotikaresistensgener ved helgenomsekvensering (WGS) Et utvalg på 30 stammer ble sendt ut til 45 laboratorier i Norge, Sverige, Danmark, Finland og Island. Laboratoriene testet stammene med den nye lappediffusjonsmetoden. Analyse av dataene pågår. Vi undersøker samsvar mellom laboratoriene og grad av korrekt karakterisering, samt nye sammenhenger mellom lappediffusjonsresultater og tilstedeværelse av antibiotikaresistensgener (som for eksempel cfiA). DELPROSJEKT 2: Molekylær undersøkelse av Bacteroides fragilis fra blodbaneinfeksjoner Prosjektet omfatter stammer av Bacteroides fragilis som er dyrket fra blod i perioden 2008-2017, hos pasienter som har hatt blodbaneinfeksjoner med B. fragilis i Vestfold, Telemark og Oslo. Målet med prosjektet er å kartlegge slektskapsforhold mellom bakteriene og endring over tid i forekomsten av genetiske elementer som har betydning for antibiotikaresistens. Stammene hentes opp fra frysearkiv og blir fortløpende undersøkt med helgenomsekvensering (WGS). I løpet av 2019 er det utført WGS av de første 69 stammene, og gendataene er blitt undersøkt for forekomsten av en rekke antibiotikaresistensgener samt flyttbare genetiske elementer. DELPROSJEKT 3: Induksjon og seleksjon av resistens Målet med delprosjektet er å undersøke om tilstedeværelse av cfiA-genet påvirker effekten av antibiotikabehandling på måter som ikke fanges opp ved vanlig resistensbestemmelse, samt om cfiA-bærende stammer er spesielt utsatt for seleksjon av resistente mutanter under antibiotikabehandling. Vi har valgt ut egnede bakteriestammer fra stammesamlingen til delprosjekt 1, og har startet arbeidet med å etablere en protokoll for forsøkene.