Karbapenemresistens hos Bacteroides fragilis

Arbeid med gendata fra Bacteroides fragilis og laboratorieforsøk for kartlegging av antibiotikaeffektDelprosjekt 1 er publisert og avsluttet, og vi har publisert vårt funn av det nye mobile genetiske elementet Tn7563. Datainnsamlingen for delprosjekt 2 er tilnærmet ferdig, og vi har fått på plass ytterligere en metode (checkerboardanalyse) som gir tilleggsdata til delprosjekt 3.Følgende aktiviteter er utført i løpet av 2023: - Vi har publisert to vitenskapelige artikkeler: resultatene fra delprosjekt 1 med en multisenterstudie av påvisningsmetoder for resistens (inkl. karbapenem- og piperacillin-tazobactam-resistens) hos Bacteroides fragilis, samt en artikkel som karakteriserer en ny genetisk mekanisme (Tn7563) oppdaget ved vårt laboratorium som oppregulerer uttrykket av resistensgenet cfiA. - Vi har fullført helgenomsekvensering av alle Bacteroides fragilis fra blodkultur i perioden 2008 til 2022 med Ion Torrent-teknologi og jobber med analyse av dataene. Doktorgradskandidaten har vært på kurs for å lære nye og mer avanserte metoder for analyse av helgenomdata. - Vi har fått på plass en bioinformatisk programvareflyt (pipeline) for å sette sammen helgenomdata når samme bakteriestamme sekvenseres med både Ion Torrent- og Oxford Nanopore-teknologi. Dette gir bedre resultater enn Ion Torrent-sekvensering alene, spesielt når det gjelder påvisning av mobile genetiske elementer, deres plassering i genomet og antall kopier de foreligger i. Vi planlegger å benytte denne metoden på de av Bacteroides fragilis-stammene i studien som bærer resistensgenet cfiA. - Vi har etablert metode for såkalt checkerboard-analyse, der vi undersøker samspillet mellom stoffene piperacillin og tazobactam, som brukes klinisk i kombinasjon til behandling av infeksjoner med Bacteroides fragilis. Vi har funnet interessante forskjeller mellom ulike grupper av B. fragilis, avhengig av om de har cfiA-genet eller ikke, og i hvilken grad genet kommer til uttrykk. Vi arbeider videre med å reprodusere og validere funnene. Dette vil bli sammenholdt med farmakokinetiske data for å beregne om man kan forvente vellykket behandling med piperacillin-tazobactam av infeksjoner forårsaket av B. fragilis med cfiA.

Helgenomsekvensering, karakterisering av nytt mobilt genetisk element og farmakodynamikkI 2022 har fokuset hovedsakelig vært på helgenomsekvensering, samt karakterisering av det nye genetiske elementet Tn7563 som vi har funnet i stamme Tbg-22. I tillegg har vi fortsatt med time-kill-forsøk.I år har vi arbeidet videre med genetisk karakterisering av Bacteroides fragilis-stammer, med spesielt fokus på stamme Tbg-22, der vi har identifisert et nytt mobilt genetisk element, Tn7563, som aktiverer resistensgenet cfiA. Det aktuelle genområdet er sekvensert med tre ulike teknologier (Ion Torrent, Oxford Nanopore og Sangersekvensering), noe som var nødvendig for sikkert å identifisere start- og endepunkt samt riktig sekvens for alle gener. De ulike sekvenseringsmetodene har forskjellige styrker og svakheter. Ved hjelp av arbeidet med stamme Tbg-22 har vi fått erfaring med dette, og vet nå mer om i hvilke tilfeller det er tilstrekkelig å bruke én metode, og når det er nødvendig å bekrefte resultatene med flere metoder. Disse kunnskapene blir benyttet videre i prosjektet, samt også i et annet av forskningsgruppens prosjekter, som omhandler bakterien Haemophilus influenzae. Vi har nå komplett sekvens for genelementet Tn7563, og har også gjort analyser som kaster lys over hvordan dette elementet kan kuttes ut av genomet og settes inn andre steder. En publikasjon om dette, som altså er en ny og ikke tidligere beskrevet mekanisme for aktivering av resistensgenet cfiA, er snart ferdigstilt. I delprosjekt 3 har vi gjennomført ytterligere time-kill-analyser, og lagt planer for videre forsøk for å bekrefte og støtte opp om resultatene. Her studerer vi hvordan uttrykk av cfiA-genet påvirker effekten av antibiotikumet piperacillin-tazobactam på B. fragilis. Tidligere forskning har studert sammenhengen mellom uttrykk av cfiA og resistens mot meropenem, men det er få data om hvordan uttrykket av dette genet påvirker følsomheten for piperacillin-tazobactam, som er mye brukt i Norge mot infeksjoner forårsaket av anaerobe bakterier som B. fragilis. Publikasjonen til delprosjekt 1 er grundig omarbeidet og under innsending til nytt tidsskrift. Vi har medvirket med data til en publikasjon om resistensbestemmelsesmetode som ble publisert i 2021 (Bavelaar H. et al.) Doktorgradskandidaten har hatt foreldrepermisjon i perioden januar-mai. Det er gjennomført midtveisevaluering.

2021: Metodeutvikling og laboratorieforsøkMye av arbeidet i 2021 har vært knyttet til metodeutvikling og laboratorieforsøk med såkalte time-kill-eksperimenter, der vi undersøker hastigheten på bakteriedrapet når Bacteroides fragilis med ulike resistensprofiler utsettes for antibiotika. Vi fortsetter også arbeidet med helgenomsekvensering av blodkulturisolater. Metodene vi har etablertFORMÅL Bacteroides fragilis er en anaerob bakterie, det vil si at den vokser i fravær av oksygen. Bakterien inngår i menneskets normale tarmflora, og kan gi infeksjoner som for eksempel sårinfeksjoner etter kirurgi, abscesser i indre organer og sepsis (blodforgiftning). Prosjektets formål er å undersøke mekanismer som gjør at B. fragilis blir resistent mot antibiotika i gruppen karbapenemer, som brukes til behandling av alvorlige infeksjoner i sykehus. De samme mekanismene gir også resistens mot piperacillin-tazobactam, et antibiotikum som brukes hyppig ved f.eks. postoperative infeksjoner. Vi ser på forekomst og spredning av gener som bidrar til resistens mot disse midlene, hvordan varierende uttrykk av genene påvirker resistens, og hvordan man med nye metoder enklest kan påvise disse resistensmekanismene i mikrobiologiske laboratorier. DELPROSJEKT 1 45 nordiske laboratorier har prøvd ut en metode for å påvise antibiotikaresistens hos Bacterodies fragilis med lappediffusjon. Doktorgradskandidaten satte sammen en stammesamling på 30 stammer som ble karakterisert med referansemetodikk. Disse ble testet med lappediffusjon av de 45 deltakende laboratoriene, som rapporterte sine funn. Vi har gjort flere interessante funn, blant annet knyttet til hvilke feilkilder som er viktigst for resistensbestemmelse mhp. ulike antibiotika og hvor godt reproduserbare resultatene er på tvers av laboratorier. Et ferdig artikkelutkast er innsendt, og er under omarbeidelse med tanke på publikasjon. DELPROSJEKT 2 Dette delprosjektet omfatter stammer av Bacteroides fragilis som er dyrket fra blod i en tiårsperiode, hos pasienter som har hatt blodbaneinfeksjoner med B. fragilis i Vestfold, Telemark og Oslo Målet med prosjektet er å kartlegge slektskapsforhold mellom bakteriene og endring over tid i forekomsten av genetiske elementer som har betydning for antibiotikaresistens. De genetiske undersøkelsene av stammene har fortsatt i 2021. Vi har også undersøkt nye metoder for helgenomsekvensering, såkalt long read-sekvensering, som gir en mer sammenhengende oversikt over bakterienes genom enn tidligere metoder. Denne metoden er aktuell å bruke i flere andre forskningsprosjekter knyttet til antibiotikaresistens. DELPROSJEKT 3 Målet med delprosjektet er å undersøke om tilstedeværelse av cfiA-genet påvirker effekten av antibiotikabehandling på måter som ikke fanges opp ved vanlig resistensbestemmelse, samt om cfiA-bærende stammer er spesielt utsatt for seleksjon av resistente mutanter under antibiotikabehandling. I 2021 har doktorgradskandidaten utført såkalte time-kill-eksperimenter på flere stammer av Bacteroides fragilis. Dette er relativt tidkrevende eksperimenter der man måler hastigheten på bakteriedrapet når bakteriene utsettes for antibiotika. Vi arbeider videre med å fullføre eksperimentene og analysere resultatene. De nye metodene som er tatt i bruk knyttet til time-kill-eksperimenter utføres for første gang i vårt laboratorium. De har gjenbruksverdi, idet både selve metodene og forskningsdesignet er aktuelt å bruke også på andre bakteriearter, som undersøkes i andre prosjekter tilknyttet forskningsgruppe for antibiotikaresistens ved Sykehuset i Vestfold. Arbeidet med helgenomsekvensering bidrar også til å heve forskningsgruppens kompetanse på dette området, noe som kommer øvrige prosjekter til gode.

Lappediffusjon, bioinformatikk og farmakodynamikkDataene fra den nordiske metodestudien for resistensbestemmelse er analysert, og har gitt ny informasjon om påvisning av antibiotikaresistens hos Bacteroides fragilis. Vi har kommet videre med helgenomsekvensering av bakteriestammer og bioinformatikkanalyser. Planleggingen av den farmakodynamiske studien i delprosjekt 3 har kommet langt.FORMÅL Bacteroides fragilis er en anaerob bakterie, det vil si at den vokser i fravær av oksygen. Bakterien inngår i menneskets normale tarmflora, og kan gi infeksjoner som for eksempel sårinfeksjoner etter kirurgi, abscesser i indre organer og sepsis (blodforgiftning). Prosjektets formål er å undersøke mekanismer som gjør at B. fragilis blir resistent mot antibiotika i gruppen karbapenemer, som brukes til behandling av alvorlige infeksjoner i sykehus. De samme mekanismene gir også resistens mot piperacillin-tazobactam, et antibiotikum som brukes hyppig ved f.eks. postoperative infeksjoner. Vi ser på forekomst og spredning av gener som bidrar til resistens mot disse midlene, hvordan varierende uttrykk av genene påvirker resistens, og hvordan man med nye metoder enklest kan påvise disse resistensmekanismene i mikrobiologiske laboratorier. DELPROSJEKT 1 45 nordiske laboratorier har prøvd ut en metode for å påvise antibiotikaresistens hos Bacterodies fragilis med lappediffusjon. Denne metoden har ikke tidligere vært standardisert for bruk på anaerobe bakterier. Doktorgradskandidaten satte sammen en stammesamling på 30 stammer som ble karakterisert med referansemetodikk. Disse ble testet med lappediffusjon av de 45 deltakende laboratoriene, som rapporterte sine funn. Vi er nå ferdige med å analysere dataene, og har et manuskript som snart er klart til publikasjon. Vi har gjort flere interessante funn, blant annet knyttet til hvilke feilkilder som er viktigst for resistensbestemmelse mhp. ulike antibiotika, hvor godt reproduserbare resultatene er på tvers av laboratorier, og i hvilken grad resultatene ved lappediffusjon kan brukes til å predikere tilstedeværelse av resistensgener. DELPROSJEKT 2 Dette delprosjektet omfatter stammer av Bacteroides fragilis som er dyrket fra blod i en tiårsperiode, hos pasienter som har hatt blodbaneinfeksjoner med B. fragilis i Vestfold, Telemark og Oslo Målet med prosjektet er å kartlegge slektskapsforhold mellom bakteriene og endring over tid i forekomsten av genetiske elementer som har betydning for antibiotikaresistens. I 2020 har vi utført helgenomsekvensering av ytterligere stammer, og har nå sekvensert totalt 146 stammer. Stammene er undersøkt for forekomsten av antibiotikaresistensgener og flyttbare genetiske elementer. Doktorgradskandidaten har deltatt på et 5-ukers kurs i bioinformatikk, og avdelingens bioinformatiker har også arbeidet med å forbedre de bioinformatiske analysene til å kunne hente ut ytterligere informasjon fra helgenomdataene. DELPROSJEKT 3 Målet med delprosjektet er å undersøke om tilstedeværelse av cfiA-genet påvirker effekten av antibiotikabehandling på måter som ikke fanges opp ved vanlig resistensbestemmelse, samt om cfiA-bærende stammer er spesielt utsatt for seleksjon av resistente mutanter under antibiotikabehandling. Vi har utarbeidet en protokoll for farmakodynamiske ekperimenter som kan kartlegge i detalj hvor effektive antibiotika er mot B. fragilis med ulike resistensrelaterte gener. Doktorgradskandidaten vil utføre disse på stammer som er nøye karakterisert under delprosjekt 1. I forbindelse med inkludering av bakteriestammer til dette delprosjektet har vi også oppdaget et mobilt genetisk element som ser ut til å være assosiert med karbapenemresistens hos B. fragilis. Vi arbeider med å karakterisere dette genelementet nøyere.

2019: Nordisk metodestudie gjennomførtI 2019 har prosjektets hovedaktiviteter vært knyttet til delprosjekt 1, der 45 nordiske laboratorier har deltatt i utprøving av en ny metode for resistensbestemmelse av anaerobe bakterier. Det har også foregått aktivitet knyttet til de andre delprosjektene.Bacteroides fragilis er en anaerob bakterie, det vil si at den vokser i fravær av oksygen. Bakterien inngår i menneskets normale tarmflora, og kan gi infeksjoner som for eksempel sårinfeksjoner etter kirurgi, abscesser i indre organer og sepsis (blodforgiftning). B. fragilis er også den anaerobe bakterien som oftest har resistens mot antibiotika. Prosjektet retter seg hovedsakelig mot B. fragilis som bærer genet cfiA, som kan gi resistens mot de viktige midlene meropenem og piperacillin/tazobactam. Genet kan ha varierende uttrykk, slik at tilstedeværelse av genet ikke nødvendigvis innebærer at bakterien er resistent. DELPROSJEKT 1: Utprøving av ny lappediffusjonsmetode for Bacteroides fragilis En vanlig metode for å påvise antibiotikaresistens hos bakterier er lappediffusjon, der man måler hvor mye bakterieveksten hemmes rundt lapper tilsatt antibiotika. Denne metoden er foreløpig ikke etablert for anaerobe bakterier. Målet med delprosjektet er å prøve ut en lappediffusjonsmetode som er utviklet for Bacteroides fragilis ved EUCAST Development Laboratory i Sverige, samt å vurdere hvordan lappediffusjon fanger opp tilstedeværelse og uttrykk av cfiA-genet. Doktorgradskandidaten har etablert en stammesamling som er karakterisert ved hjelp av følgende metoder: - Resistensbestemmelse for midlene meropenem, piperacillin/tazobactam, klindamycin og metronidazol ved hjelp av referansemetode (agarfortynning) - Påvisning av cfiA-genet ved polymerasekjedereaksjon (PCR) - Målt i hvilken grad stammene uttrykker cfiA-genet ved bruk av kvantitativ revers transkriptase-PCR (qRT-PCR) - Påvisning av andre antibiotikaresistensgener ved helgenomsekvensering (WGS) Et utvalg på 30 stammer ble sendt ut til 45 laboratorier i Norge, Sverige, Danmark, Finland og Island. Laboratoriene testet stammene med den nye lappediffusjonsmetoden. Analyse av dataene pågår. Vi undersøker samsvar mellom laboratoriene og grad av korrekt karakterisering, samt nye sammenhenger mellom lappediffusjonsresultater og tilstedeværelse av antibiotikaresistensgener (som for eksempel cfiA). DELPROSJEKT 2: Molekylær undersøkelse av Bacteroides fragilis fra blodbaneinfeksjoner Prosjektet omfatter stammer av Bacteroides fragilis som er dyrket fra blod i perioden 2008-2017, hos pasienter som har hatt blodbaneinfeksjoner med B. fragilis i Vestfold, Telemark og Oslo. Målet med prosjektet er å kartlegge slektskapsforhold mellom bakteriene og endring over tid i forekomsten av genetiske elementer som har betydning for antibiotikaresistens. Stammene hentes opp fra frysearkiv og blir fortløpende undersøkt med helgenomsekvensering (WGS). I løpet av 2019 er det utført WGS av de første 69 stammene, og gendataene er blitt undersøkt for forekomsten av en rekke antibiotikaresistensgener samt flyttbare genetiske elementer. DELPROSJEKT 3: Induksjon og seleksjon av resistens Målet med delprosjektet er å undersøke om tilstedeværelse av cfiA-genet påvirker effekten av antibiotikabehandling på måter som ikke fanges opp ved vanlig resistensbestemmelse, samt om cfiA-bærende stammer er spesielt utsatt for seleksjon av resistente mutanter under antibiotikabehandling. Vi har valgt ut egnede bakteriestammer fra stammesamlingen til delprosjekt 1, og har startet arbeidet med å etablere en protokoll for forsøkene.