A multifaceted approach to multidrug resistance in Haemophilus influenzae: exploring novel resistance mechanisms & making old antibiotics great again

Avlutning av delstudie 3 og oppstart av delstudie 1Høydepunktet i 2023 var publisering av resultatene fra delstudie 2. Delstudien ga interessante og viktige funn som kan ha betydning for fremtidige behandlingsanbefalinger ved luftveisinfeksjoner og redusere bruk av bredspektrede antibiotika. Delstudie 1 pågår, og arbeidet videreføres i 2024.DELSTUDIE 1 - Pågår Fokus er resistensmekanismer mot siste skanse-antibiotika hos H. influenzae (karbapenemer og piperacillin-tazobaktam). Slik resistens er relativt sjelden, men mekanismen er i svært liten grad studert. Vi ønsker å teste en hypotese om at resistens skyldes mutasjoner i penicillinbindende protein 2 (PBP2), som er et viktig angrepspunkt for de aktuelle midlene. Studien utføres i tre trinn: 1) Finne kandidatmutasjoner i PBP2 basert på litteratursøk og egne data fra tidligere studier (pågår) 2) Bruke genteknologiske teknikker til å lage mutanter med ulike mutasjoner (pågår) 3) Undersøke betydningen av ulike mutasjoner for bakterienes vekstegenskaper og følsomhet for antibiotika DELSTUDIE 2 - Avsluttet DELSTUDIE 3 - Avsluttet Resulterte i publikasjon i 2023 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37082420/). Formålet var "making old antibiotics great again" ved å svekke bakterienes evne til å beskytte seg. Biofilm beskytter bakteriene mot penicilliner og lignende antibiotika, og mot vertens immunforsvar. Bakterier i biofilm har økt evne til å trenge gjennom slimhinner og gi alvorlige infeksjoner. Studier har vist at antibiotika dreper bakterier mer effektivt dersom biofilmen først brytes ned med såkalte biofilmhemmere. Det finnes flere kjente biofilmhemmere, men mange er giftige og derfor ikke egnet til behandling av mennesker. "OligoG" er en biofilmhemmer som finnes naturlig i brunalger og som produseres av det norske firmaet AlgiPharma. Virkestoffet er ikke giftig, det er godkjent for bruk hos mennesker (inhalasjon), og tidligere studier har vist at OligoG har lovende egenskaper mot mange bakterier hos pasienter med cystisk fibrose. Vi studerte effekten av OligoG på to stammer av H. influenzae fra KOLS-pasienter, alene og i kombinasjon med to antibiotika som ofte brukes ved luftveisinfeksjoner (ampicillin og ciprofloksacin). Vi valgte ampicillin fordi det er et "old antibiotic" som er mindre resistensdrivende enn det nyere middelet ciprofloksacin, og som derfor foretrekkes til behandling dersom bakterien er følsom. Imidlertid kan biofilm bidra til behandlingssvikt ved behandling med ampicillin selv om resistensbestemmelse viser at bakterien er følsom. I teorien kan ampicillin derfor gjøres "great again" ved å kombinere behandlingen med en biofilmhemmer, f.eks OligoG. Hovedfunnene i studien var at OligoG hadde en doseavhengig evne til å bryte ned biofilm, og at konsentrasjonen av antibiotika som behøvdes for å hemme bakterievekst var signifikant lavere i kombinasjon med OligoG. En viktig og overraskende observasjon var at OligoG i tillegg motvirket effekten av et enzym som bryter ned ampicillin (betalaktamase), som er en utbredt resistensmekanisme hos H. influenzae. Dette er den første vitenskapelige publikasjonen som dokumenterer statistisk signifikant synergi mellom antibiotika og OligoG generelt (uansett bakterie), og den første publikasjonen som dokumenterer synergi mellom antibiotika og en biofilmhemmer hos H. influenzae spesielt. Funnene danner et viktig grunnlag for fremtidige kliniske studier av effekten av antibiotika-biofilmhemmer-kombinasjoner ved luftveisinfeksjoner forårsaket av H. influenzae, som igjen kan danne grunnlag for nye behandlingsanbefalinger. I tillegg til forbedret livskvalitet hos KOLS-pasienter og andre utsatte pasientgrupper kan funnene på sikt bidra til redusert bruk av bredspektrede antibiotika, som er et viktig tiltak for å bremse utviklingen av antibiotikaresistens.

2022: Publisering av resultater fra delstudie 2 og 3Hovedfokus i 2022 var analysering, tolkning og publisering av resultater fra to av delstudiene. Én artikkel er publisert, og én er innsendt (review pågår). De to delstudiene har gitt verdifulle erfaringer, ny kompetanse, nye eksperimentelle modeller - og lagt grunnlag for et nytt postdoc-prosjekt med forskningsmidler fra HSØ.DELSTUDIE 1 - Under planlegging Foreløpig ikke prioritert - ingen aktivitet i 2022. DELSTUDIE 2 - Avsluttet Resulterte i publikasjon i 2022 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35935209/) Prosjektet ble også presentert på Norwegian Consortium for Microbial Genomics Meeting i desember 2022 (https://www.ncmg.no/wordpress/wp-content/uploads/2022/11/NCMG_program_meeting_2022_final.pdf) Hovedfunnet i studien var beskrivelse av et nytt mobilt genetisk element (Tn7100) som kan overføres mellom ulike stammer av H. influenzae og som gjør mottakerstammen multiresistent. Elementet inneholder seks ulike resistensgener som til sammen gir resistens mot fire ulike grupper antibiotika. Fire av genene er tidligere ikke beskrevet eller sjeldent forekommende i H. influenzae. Slektskapsanalyser viste at en stamme som inneholder Tn7100 forårsaket et utbrudd i Osloregionen i 2016-2017. Observasjonen viser at stammen er i stand til å spre seg mellom mennesker og gi luftveisinfeksjoner selv om Tn7100 gir svekkede vekstegenskaper med redusert konkurranseevne ("fitness"). Studien har hatt stor nytte av kompetanse og forskningsinfrastruktur etablert i forbindelse med foregående strategisk prosjekt (2016132), herunder helgenomsekvensering, bioinformatikk inkludert slektskapsanalyser, resistensbestemmelse, vekstkinetikk og konkurranseeksperimenter. I tillegg er det etablert nye metoder og tilegnet ny kompetanse, eksempelvis overføring av mobile genetiske elementer ved konjugasjon og sekvensering med "long read" teknologi. Ikke minst har studien dannet grunnlag for tildeling av HSØ forskningsmidler til nytt postdoc-prosjekt om antibiotikaresistens og mobile genetiske elementer hos H. influenzae, med nasjonale og internasjonale samarbeidspartnere (prosjekt 2022055 - se egen rapport). DELSTUDIE 3 - Pågår (manuskript i review) Alle eksperimenter er utført, data er analysert, og et manuskript ble sendt til et internasjonalt tidsskrift i desember 2022. Review pågår (per 7/2-23). Biofilm er en viktig mekanisme for virulens (evnen til å gi sykdom) hos bakterier og innebærer at bakterien omgir seg av et beskyttende lag av biologiske substanser. Biofilm gir bakterien økt evne til å trenge gjennom slimhinner og beskytter mot både vertens immunforsvar og antibiotika. Kombinasjonsbehandling med biofilmhemmere og antibiotika er en lovende ny tilnærming til behandling av kompliserte infeksjoner, blant annet i luftveier. Studien er en av de første som beskriver interaksjoner mellom antibiotika og en biofilm-hemmer mot H. influenzae. Gjennomføring av studien har gitt økt lokal kompetanse på biofilm-relaterte infeksjoner og legemiddelinteraksjoner, herunder etablering av laboratoriemodell for studier av biofilm og matematiske/statistiske metoder for beregning av synergistisk effekt.

2021: Konjugasjonseksperimenter, fitnessanalyser & effektstudier av antibiotika på bakterier i biofilmHaemophilus benytter ulike mekanismer for å overleve i nærvær av antibiotika. I 2021 utførte vi en serie eksperimenter for å undersøke egenskapene til et nytt mobilt genetisk element med resistensgener som tidligere ikke er beskrevet hos H. influenzae, og om kombinasjon med algeekstrakt gjør antibiotika mer effektive mot bakterier i biofilm.Aktiviteter og resultater i de tre delstudiene (se 2020-rapport for bakgrunnsopplysninger): DELSTUDIE 1: PBP2-mediert betalaktamresistens Forberedende undersøkelser i form av litteraturstudier og supplerende bioinformatiske analyser av tidligere sekvenserte stammer med relevante resistensprofiler. DELSTUDIE 2: Multiresistent klon med uvanlige resistensgener Vi har funnet og karakterisert et nytt mobilt genetisk element av typen ICE ("integrative and conjugative element") som inneholder flere resistensgener som sjelden eller aldri har vært påvist i H. influenzae. Via en serie eksperimenter har vi undersøkt om ICEn kan overføres mellom bakterier ved konjugasjon (kopiering av genet og overføring ved direkte kontakt mellom bakterieceller), om ICEn gjør mottakerbakterien resistent mot de samme antibiotika som donorstammen, og om opptak av ICEn har en kostnad for bakterien i form av endrede vekstegenskaper og redusert konkurranseevne ("fitness"). Resultatene tilfører ny kunnskap om resistensepidemiologi og mekanismer for utvikling av multiresistens hos H. influenzae. Manuskript er under utarbeidelse og forventes publisert i internasjonalt tidsskrift i løpet av 2022. Lokalt har studien har bidratt til økt kompetanse og etablering av nye eksperimentelle modeller som vil være av stor nytteverdi i fremtidige studier. Et oppfølgingsprosjekt med internasjonal deltagelse er under planlegging og fikk tildelt forskningsmidler fra Helse Sør-Øst i 2021. DELSTUDIE 3: Effekt av algeekstrakt på biofilm og antibiotikaeffekt Vi har etablert en eksperimentell laboratoriemodell for biofilm hos H. influenzae og undersøkt i hvilken grad biofilm beskytter bakterien mot ulike typer antibiotika. Videre har vi undersøkt om det er synergistisk effekt mellom antibiotika og ekstrakt fra en brunalge som tidligere har vist å ha effekt på biofilm hos andre bakterier. Resultatene tilfører ny kunnskap om betydningen av biofilm for effekten av antibiotikabehandling av infeksjoner forårsaket av H. influenzae og danner verdifullt grunnlag for oppfølgingsstudier av den kliniske nytteverdien av brunalgeekstrakt og andre biofilmhemmere. Manuskript er under utarbeidelse og forventes publisert i internasjonalt tidsskrift i løpet av 2022. Etablering av laboratoriemodellen og utførelse av eksperimentene inngikk i en masteroppgave ved OsloMet for en av prosjektdeltagerne (levert og godkjent i 2021). Lokalt har studien har bidratt til økt kompetanse og etablering av nye eksperimentelle modeller som vil være av stor nytteverdi i fremtidige studier, herunder oppfølgingsprosjektet som er beskrevet under Delstudie 2.

2020: Fokus på multiresistens og biofilm hos Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae er en viktig årsak til infeksjoner og antibiotikabruk, og antibiotikaresistens er et økende problem. I dette prosjektet fokuserer vi på nye og uvanlige mekanismer for resistens - med særlig vekt på overførbar multiresistens. I tillegg undersøker vi om et stoff i brunalger kan gjøre bakterien mer følsom for antibiotika.FORMÅL Prosjektet består av tre delstudier, som vil gi ny kunnskap om variasjonsbredden i resistensmekanismer, utvikling og spredning av ulike typer resistens og hvordan disse påvirker bakteriens fitness, og potensialet for en naturlig biofilmhemmer til å øke følsomheten for antibiotika. DELSTUDIE 1: Gir mutasjoner i penicillinbindende proteiner (PBP) resistens mot meropenem og piperacillin? Meropenem og piperacillin er "reservemidler" i betalaktamgruppen og forbeholdes alvorlige infeksjoner hvor andre antibiotika ikke virker. De påvirkes lite av mutasjoner i PBP3, som er den eneste kjente kromosomale resistensmekanismer mot betalaktamer. Årsaken er at disse midlenes viktigste angrepspunkt er PBP2. I denne studien vil vi undersøke om endringer i PBP2 kan gi resistens mot meropenem og piperacillin. Ved hjelp av transformasjon (opptak av fritt DNA) med syntetisk DNA og DNA fra kliniske resistente stammer vil vi lage mutanter og kartlegge effekten av ulike PBP2-mutasjoner på følsomhet for antibiotika og bakteriens fitness (veksthastighet og konkurranseevne). Dersom PBP2-mediert resistens kan lages i laboratoriet vil dette trolig også kunne oppstå i naturen. Dette innebærer at det må etableres systemer for å overvåke forekomsten av slik resistens, og unødvendig bruk av meropenem og piperacillin bør reduseres for å forsinke utviklingen av resistens. Prosjektet er foreløpig i planleggingsfasen. DELSTUDIE 2: Karakterisering av multiresistent klon Delstudien tar utgangspunkt i funn av en multiresistent klon i prosjektet "Evolution and spread of high-level beta-lactam resistance in Haemophilus influenzae". Klonen har en tidligere ubeskrevet kombinasjon av overførbare resistensgener mot flere typer antibiotika. Foreløpig karakterisering av stammen med helgenomsekvensering og bioinformatiske analyser har avdekket at resistensgenene er samlokalisert på et nytt mobilt genetisk element. Dette elementet er av en type som gjør det i stand til å overføre en kopi av seg selv til andre bakterier i nærheten (konjugasjon). Denne typen overførbar resistens innebærer at bruk av ett antibiotikum vil kunne selektere for resistens mot flere antibiotika samtidig. I prosjektet vil vi studere hvor effektiv overføring mellom bakterier er, hvordan det mobile genetiske elementet uttrykkes i mottakerstammen, og hvordan elementet påvirker bakteriens fitness. Vi har utført tredjegenerasjonssekvensering for å få et komplett, sammenhengende genom, karakterisert det mobile genetiske elementet ved hjelp av bioinformatiske analyser, og etablert metodologi for konjugasjon og fitnessanalyser. DELSTUDIE 3: Effekt av biofilmhemmer Biofilm er en bakteriell livsform hvor bakteriene danner "samfunn" av bakterieceller på overflater, omgitt av et beskyttende lag ("matrix") som bl.a består av proteiner og DNA. I biofilm er bakteriene beskyttet mot antibiotika og angrep fra vertens immunforsvar, de kan utveksle genetisk informasjon, og de kan penetrere epitelceller og gi invasive infeksjoner. Biofilmhemmere har et stort potensiale for profylakse og behandling av infeksjoner. I denne delstudien vil vi etablere en eksperimentell biofilm-modell for å kunne studere hvordan biofilm påvirkes av ulike typer antibiotika, og om det er synergistisk effekt mellom antibiotika og en brunalge som tidligere har vist biofilmhemmende effekt på andre bakterier. Etablering av modellen og utførelse av eksperimentene inngår i et pågående masterprosjekt for bioingeniør Kaja Marienborg ved OsloMet.