Hypoxia and reoxigenation of the newborn. The significance of inflammation. An experimental study

1) Funnene av tidligere markører ved mimikert nyfødtsepsis gir oss bedre grunnlag for å avgjøre om et nyfødt infeksjonssykt barn bør behandles med antibiotika. 2) Vi tror at disse funnene bidrar til å utvikle enklere men like effektiv nyfødtresuscitering som trolig også er mer beskyttende for hjernevev.

Dannevig skriver sammen sin avhandling mens hun er i fødselspermisjon. Avhandlingen er "The impact of alternative resuscitation strategies in newly born pigs with emphasis on inflammatory responses in brain and lung tissue and the time to return of spontaneous circulation"

Østerholt disputerer med følgende publikasjoner 1) Østerholt HCD, Dannevig I, Wyckoff MH, Liao J, Akgul Y, Ramgopal M, Milja, DS, Cheong N, Longoria C, Mahendroo M, Nakstad B, Saugstad OD and Savani RC Antioxidant protects against increases in low molecular weight hyaluronan and inflammation in asphyxiated newborn pigs resuscitated with 100% oxygen. 2) Østerholt HCD, Lundeland B, Sonerud T, Saugstad OD and Nakstad B The impact of hyaluronan on monocyte Toll-like receptor expression in term infant cord blood 3) Inchley CS, Østerholt HCD, Sonerud T, Fjærli HO, Nakstad B. Downregulation of IL7R, CCR7 and TLR4 in the cord blood of children with respiratory syncytial virus disease. Østerholtsi avhandling "Hyaluronan and Toll-like receptor 4 in neonatal asphyxia and infection. An experimental study in newborn pigs and umbilical cord blood" samler de 3 artiklene.

Dannevig skriver sammen sin avhandling mens hun er i fødselspermisjn i avhandlingen "The impact of alternative resuscitation strategies in newly born pigs with emphasis on inflammatory responses in brain and lung tissue and the time to return of spontaneous circulation" med følgende publikasjoner 1) Dannevig I, Solevåg AL, Wyckoff M, Saugstad OD, Nakstad B. Delayed onset of cardiac compressions in cardiopulmonary resuscitation of newborn pigs with asphyctic cardiac arrest. Neonatology. 2011;99(2):153-62. Epub 2010 Sep 11. 2) Dannevig I, Solevåg AL, Sonerud T, Saugstad OD, Nakstad B Brain inflammation induced by severe asphyxia in pigs and the impact of alternative resuscitation strategies on the newborn central nervous system. Pediatriatric Research. 2012 Nov 20. doi: 10.1038/pr.2012.167. [Epub ahead of print] PMID: 23168577 3) Dannevig I, Solevåg AL, Saugstad OD, Nakstad B Lung injury in asphyxiated newborn pigs resuscitated from cardiac arrest - the impact of supplementary oxygen and longer ventilation intervals before initiation of chest compressions at different compression-to-ventilation ratios. Open Respir Med J. 2012; 6: 89-96. Epub 2012 Sep 20.

Two PhD candidates are currently writing up their thesis based on their published or submitted papers. Their submissions of their PhD thesis are planned in 2013. Due to permissions for child births, and full clinical positions these PhD projects have been delayed.

Dannevig I: The Impact of alternative resuscitation in newly born pigs with emphasis on inflammatory responsis in brain and lung tissue and the time to return of spontaneous circulation".

We report that an initial ventilation time of 60 s, but not as long as 90 s, gives similar time of return to spontaneous circulation, and induce less brain and lung injury than the 30 s guidelines of today. The compression to ventilation ratio of 15:2 and 9:3 is as good as 3:1.

Østerholt HC: "Hyaluronan degradation in asphyxiated newborn pigs resuscitated with 100% oxygen. Clinical and immunological aspects of hyaluronan and Toll-like receptors 2 and 4."

How hyaluronan may modulate the immune response in severe asphyxia, possibly during neonatal sepsis and needed resuscitation is the research questions raised in this project.

The animal model traditionally does not take the animals as far as cardiac arrest as was the case here, and cases with asystole are by far outnumbered by bradycardia in newborns requiring resuscitation at their birth, still our results are likely to be of evidence –based value when it comes to changes in practise. In the case of bradycardia (HR<60 bpm) one should be more patient before giving up on ventilation only and cardiac compressions are initiated. However, customising guidelines is obviously at the expense of simplification, and retention of resuscitation skills is easier if guidelines are simplified. The changing of guidelines is therefore a complex issue.

The mechanisms by which hyperoxia exposure results in systemic inflammation are unclear. Hyaluronan (HA) is fragmented to low molecular weight (LMW) by oxidative-nitrative stresses and can promote inflammation.

Two papers are under evaluation in two different international peer reviewed journals focusing on 1) HA signalling through Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4, which are key components of the innate immune system and 2) The HA effects of oxygen resuscitation on lung 3-nitrotyrosine (3-NT), LMW HA, TNFa and IL1ß in a newborn piglet model of resuscitation.

Based on the above referred protocol two PhD candidates are currently writing up their last manuscripts and hopefully will be ready for submission of their thesis in 2012. They have been in 50/50% clinical position/research fellow. Permissions due to birth of babies have delayed their progression towards their PhD graduation.

Progresjonen i prosjektet for de to PhD studenter som deler bevilgningen har vært betydelig forsinket pga fødselspermisjoner. Bevilgningen for 2010 er dels brukt til lønn for de to PhD studenter (men de har også deler av 2010 hatt permisjon) samt til noe laboratorieutstyr for analyser av vev, og brukt til delvis dekning av løpende driftsutgifter.

Hyaluronsyre (HA) finnes i høy- og lavmolekylære former. Mens den høymolekylære formen av HS er vist å kunne beskytte mot inflammasjon, er den lavmolekylære formen vist å virke proinflammatorisk, dvs stimulere inflammasjonsprosessen ytterligere.

Vi har tidligere gjennomført en serie på forøksdyr (spedgris) og sett hvordan oksygenmangel og deretter reoksygenering påvirker hyaluronsyre molekystørrelse og deponering i lunger. Manuskriptet er under bearbeidelse.

Vi har analysert cerebrospinalvæske fra spedgrismodellen når disse ble resuscitert fra 1) alvorlig asfyksi (BT<20 og BE<-20) og deretter reoksygenert/resuscitert 2) som 1) men forbehandlet med naturlige antioksidanter og 3) fra full hjertestans og deretter reoksygenert/ resuscitert. Dette skrives sammen til et manuskript.

Deretter ønsket vi å mimikere tilstanden med septikemi hos nyfødte og se om hyaluronsyre som kan bli et terapeutisk alternativ til surfactant og da kan lekke fra lungene med et skadet kapillærnett til blodet og der muligens hemme eller øke den inflammatoriske reaksjonen i blodets monocytter. Vi ønsket å finne om høymolekylær eller lavmolekylær hyaluronsyre kan endre monocyttenes ekspresjon av toll-like reseptorer (TLR) som regulerer og detekterer invaderende patogener. Vi fant at HMW HA nedregulerer ekspresjonen av TLR 4 mens det ikke var noen forskjell for TLR2. LMW HA fragmenter kan via cytokin nettverket stimulere inflammatoriske responser og vi fant en signifikant økning av TNF alpha etter LMW stimulering.

De to PhD studenter planlegger å skrive sammen PhD graden og levere i løpet av 2011- 2012

We have done pig series experiments as those described below:

We undertook the first experimental series investigating room air versus 100% oxygen and the compression-to-ventilation (C:V) ratio of 9:3 and 15:2 versus 3:1 in resuscitation of newborn piglets with cardiac arrest following severe asphyxia. In this series we also investigated prolongation of positive pressure ventilation before initiation of cardiac compressions in the same model; i.e 90 sec and 60 sec versus 30 sec.

The results of the experiments have in 2009 been presented at the 2009 Pediatric Academic Societies meeting in Baltimore and written up in articles and submitted with the following titles:

*Resuscitation of severely asphyctic newborn pigs with cardiac arrest by using 21% or 100% oxygen Neonatology 2010;98:64-72 (DOI: 10.1159/000275560)

*Extended series of cardiac compressions during CPR in a swine model of perinatal asphyxia Submitted to Resuscitation (under consideration after revisions)

*Delayed onset of cardiac compressions in CPR of newborn pigs with asphyctic cardiac arrest. Submitted to Neonatology (under consideration after revisions)

In April/May 2009 the second experimental series was undertaken. We applied the same piglet model in order to investigate the C:V ratio of 15:2 (which is the currently recommended ratio in resuscitation of all children except newborns). Preliminary results have been submitted as an abstract to the 2010 Pediatric Academic Societies meeting in Vancouver. The results will be further analyzed and written up in a final article in 2010, possibly being submitted to Resuscitation.

Several animal studies conclude that phytochemicals with antioxidative properties may be promising drug candidates to newborn after hypoxia and reoxygenation due to results like better oxygenation and down-regulation of inflammation.

Using newborn pig models we intend to find ways of intervening in the process leading to cell damage by trying different strategies for resuscitation and by giving biological active molecules with antioxidative properties to the asphyxiated pigs.

We have done two pig series of experiments in 2008:

1) Anaesthetized newborn pigs were randomized to either hypoxia or control groups, and pretreatment with either a solution with antioxidative properties or placebo. The pigs had a stabilization period of 60 minutes and were given hypoxia 8% O2 in N2 until base excess levels were below -20 mmol/L and/or mean arterial blood pressure were below 15 mmHg. They were then resuscitated with either 21% or 100% O2 for 30 min and ventilated with 21% O2 for 120 min before they were euthanized.

2) Newborn pigs were anaesthetized, tracheotomized and mechanically ventilated. After 60 min of stabilization, progressive asphyxia was induced by adding CO2 to achieve pCO2 > 7.0 kPa. O2 was reduced to 8% and the ventilator rate reduced by 10 breaths per min every 10 min until asystole. At asystole, cardiopulmonary resuscitation was initiated. We tested inspired O2 21% versus 100%, positive pressure ventilation for 30 seconds versus 1 minute or 1,5 minute before initiation of cardiac compressions, and a variation of compressions and ventilations with either 3:1 or 9:3. If there was no spontaneous circulation (unassisted pulsatile rhythm at a rate of =100/min) after 15 min of resuscitation, the procedure was ended. If the resuscitation resulted in spontaneous circulation within 15 min, the animals were observed on the ventilator for 4 hours before euthanasia.

Tissue analyses: We are in the process of examining gene and protein expression of inføøatory and hyaluronic acid associated cytokines and receptors.

Conclusion/preliminary results

In the series where antioxidative properties were tested, IL-6 increased significantly in frontal cortex of the brain for the 100% O2 group compared to the 21% O2 group. IL-6 was not significantly related to the solution with antioxidative properties.

The values of several pro-inflammatory cytokines are currently being analysed and compared between the two series of different resuscitation strategies and also compared to the intervention of antioxidants throughout the asphyxia period.

Målet er å finne hvordan hyaluron systemet påvirkes ved asfyksi og påfølgende resuscitering både ved bradycardi og mer ekstremt ved asystoli, samt finne om tilførte naturlige antioksidanter påvirker de biologiske prosessene. Hvordan prosessene påvirkes ved samtidig asfyksi og infeksjon (LPS) er klinisk relevant og vil undersøkes.

Prosjektet deles mellom to stipendiater i doktorgradprogrammet ved UiO, Helene Østerholt og Ingrid Dannevig, hvorav den ene, HØ, har hatt svangerskapspermisjon i ett år av stipendiatperioden. Prosjektet er et samarbeid med prof Savani, Southwestern University Hospital, Dallas, Texas og Pediatrisk forskningsinstitutt, Rikshospitalet ved professor Saugstad.

Det har vært gjennomført to griseserier mens en tredje serie er i gang. Noen av analysene gjøres i Dallas hos professor Savani mens vi gjør morfologiske studier og utfører protein- og genekspresjonsanalyser med primere for HA reseptorer og enzymer i HA syntesen. Forstudier har vært tidkrevende men vi er nå godt i gang med analysene. Spesielt har vi ventet lenge på resultater fra Dallas noe som har forsinket oss.

Serie 1 hvor til sammen 60 spedgriser ble inkludert og påført hypoksi til BE -20 eller BT mean < 20 før reoksygenering med ulike oksygenkonsentrasjoner har gitt 2 abstrakter som er akseptert for Pediatric Academic Societies (PAS) Annual Meeting i Hawaii mai 2008;

Vi fant at det er økning av hualuronsyre i små og større luftveier men ikke i alveoler i spedgriser resuscitert med 100% oksygen etter hypoksi sammenlignet med 21%. Disse resultatene viser at det er viktig med lav O2 konsentrasjon under resuscitering. Peroksynitritt bryter ned høymolekylær hyaluronsyre til den ugunstige lavmolekylære formen av HA. 3NT gjenspeiler peroksynitritt-nivået. Vi har i studien påvist en økning av 3-nitrotyrosin etter gjenoppliving med 100% oksygen. Abstraktene er (1) ”Newborn Piglet Resuscitation With 100% O2 Is Associated with Increased Lung 3-Nitrotyrosine and Decreased Hyaluronan”. Østerholt HCD et al. (2) “Resuscitation after hypoxia with 100% oxygen increases the amount of Hyaluronic acid in airways compared to resuscitation with 21% oxygen in a model with newborn pigs.” Ingrid Dannevig et al. Artikler er under bearbeidelse.

I serie 2 undersøkte vi spedgriser som ble forbehandlet med en blanding av potente, naturlige antioksidanter før hypoksi til BE-20 eller hypotensjon. Dyra ble resuscitert med ulike konsentrasjoner av oksygen. Til sammen 40 griseunger ble inkludert i denne studien og vi er i gang med analysene. Vi har funnet signifikante forskjeller mellom gruppene for IL-6 og dette er sendt som abstract til presentasjon ved European Pediatric Society i Nice oktober 2008. ”Resuscitation with 21% oxygen decreases brain levels of interleukin 6 in hypoxic newborn piglets pretreated with phytochemicals or placebo compared to 100% oxygen” Ingrid Dannevig et al. Avhengig av resultatene vi oppnår så vil artikler bli sammenskrevet snart.

Vår forskergruppe gjennomfører nå en tredje serie hvor spedgris kjøres til asystole og alvorlig metabolsk acidose før resuscitering med ventilering og hjertekompresjon samt adrenalin etter gjeldende internasjonale retningslinjer for resuscitering. Regulering av HA-reseptorer vil undersøkes ved mer ekstreme asfyktiske forhold (asystoli) enn over og blir etter fulgt av resuscitering ved ulike O2 konsentrasjoner.