Epigenetiske faktorers betydning for utvikling av autoimmun sykdom

Epigenetiske faktorers betydning for utvikling av autoimmun sykdomUtvikling av sykdom er hovedsakelig et resultat av genetikk og miljø. Miljøet er påvist å kunne utøve sin effekt gjennom en endring av epigenetiske mønstre. Disse såkalte epigenetiske forandringene er med på å bestemme om et gen uttrykkes eller ikke i ulike vev. Hovedhensikten med denne studien har vært å kartlegge i hvilken grad epigenetiske faktorer, i form av DNA metylering, er involvert i utviklingen av immun-medierte sykdommer.I den senere tid har det vist seg at en rekke sykdommer er forårsaket av epigenetiske forandringer, både i enkelte gener, men også ved globale forandringer i epigenomet. Bakgrunnen for dette prosjektet har vært å studere i hvilken grad og hvordan effekten av epigenetikk påvirker risikoen for å utvikle immun-mediert sykdommer. Epigenetiske mønstre er vist å være celle-spesifikke og dette er et essensielt aspekt ved studier av epigenetikk relatert til sykdom. Studier av eneggede tvillinger som er diskordante for sykdom er et godt verktøy for å kunne skille genetiske og ikke-genetiske faktorers bidrag til utvikling av sykdom. Immun-medierte sykdommer er utbredt på verdensbasis og har stor innvirkning på folkehelsen. Psoriasis er mest sannsynlig den mest utbredte immun-medierte sykdommen på verdensbasis og er estimert å ramme om lag 25 millioner mennesker i Europa og Nord-Amerika. Psoriasis ansees som en kompleks sykdom, men de genetiske faktorene som er kjent kan ikke samlet sett alene forklare utviklingen av sykdom. Forskningen på det epigenetiske aspektet ved denne sykdommen er foreløpig i startgropen og dette prosjektet er å anse som banebrytende i så måte. Et sentral og omfattende del av dette prosjektet har vært innsamling av blodprøver fra eneggede tvillinger som er diskordante for immun-medierte sykdommer som psoriasis og astma og etablering av en biobank ved avdelingen. Ulike celletyper har ulike epigenetiske mønster og vi har isolert flere celletyper for å kunne avdekke celle-spesifikke epigenetiske forandringer. Pr i dag består denne biobanken av > 7000 rør med isolerte celler som har en sentral rolle i immunsystemet, ekstrahert DNA, RNA og plasma. I tillegg er det samlet inn biopsier fra affisert og frisk hud fra tvillinger som er diskordante for psoriasis. Det er en rekke nasjonale og internasjonale samarbeidsprosjekter direkte knyttet til biobanken. I tillegg er det igangsatt en utvidelse av biobanken gjennom et samarbeid med det svenske tvillingregisteret for innsamling av tvillinger som er diskordante for psoriasis. Det har i løpet av 2011 vært stor forskningsaktivitet tilknyttet dette 3-årige prosjektet som nå er i sluttfasen. En studie der vi har sett på variasjon og arvelighet av DNA metylering ved hjelp av såkalt bisulfit sekvensering er publisert (Gervin K et al. 2011 Genome Research). I denne studien ble det avdekket stor grad av variasjon i DNA metylering blant friske eneggede og toeggede tvillinger. I den samme studien ble det avdekket liten grad av arvelighet av DNA metylering. I en annen omfattende studie identifiserte vi gener der forskjeller i DNA metylering hos eneggede tvillinger som er diskordante for psoriasis også førte til en endring av genuttrykk i CD4+ celler. En rekke av disse genene inngår i signalveier som har en viktig rolle i immunresponsen og dette kan tyde på en epigenetisk feilregulering av disse signalveiene. Denne studien er nylig publisert (Gervin K et al. 2012, PLoS Genetics). En av målsetningene for prosjektet har vært å utvikle og etablere metoder for å studere DNA metylering ved hjelp av såkalt ”high-throughput” bisulfit sekvensering. I motsetning til array-baserte metoder som ser på ~ 0.001% av CpG setene i genomet, vil vi med metoden som nå er etablert ved avdelingen kunne se på 10-12% av CpG-setene. Dette prosjektet er nå i sluttfasen og sekvensering av tvillingene som er diskordante for psoriasis er i ferdigstilt. Vi er i gang med analyseringen av disse dataene og håper å kunne identifisere de genene i signalveiene som vi fant i den nylig publiserte studien. I tillegg planlegger vi å utføre RNA-sekvensering som også vil gjøre det mulig å se på spleisevarianter av gener og hvordan disse er regulert av DNA metylering. Som en del av et stort europeisk samarbeidsprosjekt (ENGAGE) er tvillingene som er diskordante for psoriasis valgt ut til ytterligere analyser av DNA metylering ved bruk av andre metoder. Samlet sett vil disse tvillingene være gjenstand for en meget omfattende kartlegging av DNA metylering.

Epigenetiske faktorers betydning for utvikling av autoimmun sykdomUtvikling av sykdom er hovedsakelig et resultat av genetikk, miljøfaktorer, epigenetiske mekanismer og tilfeldige hendelser. Hovedhensikten med denne studien har vært å kartlegge i hvilken grad epigenetiske faktorer, i form av DNA metylering, er involvert i utviklingen av autoimmune sykdommer. Prosjektet har avdekket gener som har en viktig funksjon i immunforsvaret som er under epigenetisk kontroll og som er assosiert med psoriasis.Psoriasis er en arvelig, kronisk hudsykdom som rammer 1-2 % av befolkningen på verdensbasis. Denne sykdommen ansees som en autoimmun sykdom, og er som regel et resultat av en feilregulert immunrespons der immunforsvarets celler går til angrep på sin egen kropp, og dermed utvikling av sykdom. En rekke gener er assosiert med utvikling av psoriasis, men miljøinduserte epigenetiske forandringer er trolig også involvert, ettersom konkordansraten blant eneggede tvillinger kun ligger mellom 35-70 %. Epigenetiske mekanismer er sentrale i aktiveringen, differensieringen og minnet til T lymfocytter. Man kan se for seg et senario der en unormal aktivering av disse cellene, etterfulgt av en invadering i huden og en kaskade av ulike hendelser til slutt kan resultere i utvikling av psoriasis. DNA metylering har en sentral rolle i reguleringen av gener og en eventuell feilregulering vil kunne føre til utvikling av sykdom. Eneggede tvillinger som er diskordante for sykdom er en ideell modell for å studere det epigenetiske bidraget til utvikling av psoriasis. I denne studien har vi samlet inn blodprøver og biopsier fra huden (sykt og frisk hud) fra eneggede tvillinger som er diskordante for psoriasis. Ulike celletyper har ulike epigenetiske mønster (epigenom) og som et viktig ledd i innsamlingsprosessen har vi isolert flere ulike celletyper for å kunne avdekke celle-spesifikke epigenetiske forandringer. Dette er helt essensielt i et så heterogent vev som blod. Vi har undersøkt DNA metylering og uttrykk av så og si alle gener i genomet ved å bruke array-baserte metoder. Gjennom analyser av disse dataene har vi identifisert gener der forskjeller i DNA metylering hos frisk og syk tvilling også førte til forskjellig uttrykk av genene i CD4+ celler. Dette er i all hovedsak gener som har en viktig rolle i immunresponsen og sentrale i hvordan cellene i immunforsvaret kommuniserer seg i mellom. På denne måten har vi avdekket gener der DNA metylering har en funksjonell betydning. Dette tyder også på at DNA metylering kan være involvert i en feilregulering av biologiske signalveier som er involvert i patogenesen og dermed nye potensielle terapeutiske mål. Det vil snart publiseres resultater av dette studiet.

Epigenetiske faktorers betydning for utvikling av autoimmun sykdomHovedhensikten med denne studien er å kartlegge hvorvidt epigenetiske forandringer, i form av DNA metylering, kan være med på og påvirke utviklingen av autoimmune sykdommer.Det har i 2009 vært liten progresjon i dette prosjektet grunnet svangerskapsrelatert sykemelding fra og med 17.02.09 etterfulgt av svangerskapspermisjon fra og med 01.06.09 til og med 01.03.10. Vi ber derfor om at prosjektet forlenges tilsvarende dette. Viktig som grunnlaget for denne studien er innsamlingen av relevant materiale, og da spesielt T-lymfocytter som er involvert i patogenesen av autoimmune sykdommer. Vi samler inn dette materialet gjennom en omfattende og tidkrevende celleseparering av ulike celletyper involvert i immunforsvaret med vanlige blodprøver som utgangspunkt. Vi har i løpet av de siste to årene samlet inn et stort antall friske eneggede og toeggede tvillinger og eneggede tvillinger som er diskordante for psoriasis, astma og IBD (inflammatorisk tarmsykdom) som et ledd i etableringen av en stor biobank som gir et unikt grunnlag for mange prosjekter. Videre har det blitt etablert ulike metoder for å kunne avdekke epigenetiske variasjoner. Dette gir et godt utgangspunkt for nye prosjekter. I tillegg til opplistet publikasjon er vi i sluttfasen med et manus der vi har avdekket DNA metylering ved hjelp av bisulfit sekvensering av 186 relevante regioner i HLA-komplekset i friske eneggede og toeggede tvillinger. Dette komplekset inneholder en rekke gener som er involvert i mange autoimmune sykdommer og derfor et relevant område i genomet å starte. Analyser har avdekket overraskende små forskjeller hos både eneggede og toeggede tvillinger noe som vitner om at en felles miljøpåvirkning ser ut til å ha vært avgjørende for etableringen av DNA metyleringen i dette kandidatområdet.

Epigenetiske faktorers betydning for utvikling av autoimmun sykdomEpigenetikk refererer bl.a. til studier av metylering av DNA molekyler og modifiseringer av de proteinene DNA molekylene er bundet til (histoner). Hovedhensikten med denne studien er å se hvorvidt forskjeller i epigenetiske faktorer kan være med på å bestemme om en person utvikler autoimmune sykdommer.Epigenetiske faktorer er påvist å ha betydning for disposisjonen for en rekke humane sykdommer. Av vanlige sykdommer er til nå kreft den best studerte og det er godt dokumentert at epigenetiske faktorer har betydning for patogenesen. Autoimmune sykdommer er kjennetegnet ved at immunforsvaret tilsynelatende går til angrep på kroppens egne celler. Hvilke celler og vev som angripes er avgjørende for hvilken sykdom man utvikler. Autoimmune sykdommer har mange fellestrekk og de er genetisk komplekse sykdommer med mange gener involvert. Miljøfaktorer spiller en viktig rolle, noe som kan dokumenteres ved å se på konkordansraten hos eneggede tvillinger, som for autoimmune sykdommer generelt ligger på 50% eller lavere. Sist, men ikke minst viktig for denne studien, er at spesielt T-lymfocytter er helt sentrale i patogenesen. Fordi epigenetiske modifiseringer er vevsspesifikke er det helt essensielt å studere de relevante cellene som er involvert i patogenesen. I autoimmune sykdommer er det immunforsvarets celler som er involvert, og vi har samlet inn disse ved å ta en alminnelig blodprøve og videre isolert ulike typer av lymfocytter. Gener i det såkalte HLA-komplekset er involvert i så godt som alle autoimmune sykdommer. Det har derfor vært nærliggende å studere gener og andre relevante områder i denne regionen som grunnlag for studier av eneggede tvillinger som er diskordante for autoimmune sykdommer. Som basis for et slikt studie har det i forkant vært viktig og avdekke hvor stor variasjon i DNA metylering som er vanlig i befolkningen. Gjennom såkalt bisulfitsekvensering har vi avdekket mønsteret for DNA metylering i 186 relevante regioner hos 178 friske tvillinger. De foreløpige resultatene har avdekket stor variasjon og oppsiktsvekkende høy korrelasjon innad i tvillingparene. Dette har for oss vært svært spennende fordi det tyder på at felles miljøpåvirkning har stor betydning for etableringen av mønsteret for DNA metylering. I denne studien ønsket vi i tillegg å se om det epigenetiske laget med informasjon også kan være arvelig. Dette har vi gjort ved å sammenligne mønsteret for DNA metylering blant eneggede og toeggede tvillinger. De 178 tvillingene som inngikk i studien bestod av 49 eneggede og 40 toeggede tvillingpar. Fordi toeggede tvillinger deler halvparten av genomet kunne vi ved å sammenligne forskjeller i DNA metylering mellom eneggede og toeggede tvillingpar få et mål på arvelighet av epigenetisk variasjon. Foreløpige resultater viser tilsynelatende små forskjeller både hos eneggete og toeggete tvillinger, noe som tyder på at felles miljøpåvirkning er viktig for etableringen av det epigenetiske laget med informasjon. Dette er med på å forsterke hypotesen om at forskjeller i epigenetiske mønstre for en stor del kan tilbakeføres til miljøet. Denne studien vil publiseres i løpet av kort tid og vil være det første i sitt slag som tar for seg DNA metylering på et så detaljert nivå i et stort antall individer ved bruk av relevant vev. Vi har det siste året etablert en rekke metoder for studier av DNA metylering ved avdelingen og er godt forberedt for videre prosjekter. Et stort prosjekt der vi ser på global DNA metylering ved såkalt high-throughput bisulfitsekvensering ved å ta i bruk ”neste generasjons sekvensator” er påbegynt og vil kunne avdekke epialleler som er essensielle for utvikling av sykdom. I første omgang ser vi på prøver fra innsamlede eneggede tvillingpar som er diskordante for psoriasis.

Epigenetiske faktorers betydning for utvikling av autoimmun sykdomI de senere år er det blitt klart at vårt arvemateriale (genom) kan modifiseres kjemisk og at dette er en normal prosess som er viktig for hvorvidt gener kommer til utrykk og i neste omgang for celledifferensiering. I denne studien ønsker vi å se på hvorvidt epgienetisk variasjon kan være av betydning for utvikling av sykdom.Epigenetisk variasjon i form av metylering av bestemte baser (C) i våre DNA molelyler og modifisering av DNA bindende proteiner (bl.a. histoner)er viktige for å bestemme hvorvidt et gen kommer til uttrykk i en celle eller ikke. I denne studien vil vi studere genetisk identiske tvillinger (eneggete tvillinger) hvor en av tvillingene har en immunmediert sykdom og den andre er frisk for å se om vi kan finne sykdomsassosiert epigenetisk variasjon. Epigenetisk variasjon varierer med celletype, og for mange immunmedierte sykdommer antas CD4 positive T-lymfocytter å være viktig for sykdomsutvikling. Vi vil derfor fokusere våre studier på denne celletypen. I praksis innebærer det at vi tar blodprøver fra tvillingene og ved hjelp av antistoffer sorterer vi ut disse cellene. Noen av cellene blir analysert for DNA metyleringsmønstre mens andre blir analysert vha såkalt kromatin immunpresipitteringsteknikk (ChIP). Denne studien kom i gang sent på høsten 2007 hvor doktorgradsstipendiat Kristina Gervin ble ansatt for å jobbe med det. Det er derfor foreløbig ikke noen publiserte resultater. Derimot er prøveinnsamling fra tvillingene vel i gang og mye metodeetablering har blitt fullført; eksempelvis cellesortering med en AutoMacs cellesorterer, DNA og RNA ekstraksjon av prøvene er gjort og vi har i 2008 kommet i gang med et par prosjekter som innebærer bisulfittsekvensering (metode for å undersøke DNA metylering) av DNA prøver fra tvillingene. Vi har kunnet demonstrere ved flow cytometri at vi får veldig rene cellepopulasjoner med cellesorteringsmetoden vi benytter. Vi har godt håp om at studien vil kunne gi oss ny viten om hvorfor spesifikke immunmedierte sykdommer oppstår og identifisere nye mekanismer som forhåpentligvis på litt lenger sikt vil kunne lede til mer effektiv behandling. Studien vil også kunne gi svar på hvordan arv og miljø samvirker i å forårsake disse sykdommene.