CCN2/CTGF: A Novel Cardioprotective Factor in Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury and Heart Failure

Prosjektet er et preklinisk grunnforskningsprosjekt med translasjons- og innovasjonspotensiale. Funnene ledet til en DOFI og patentsøknad (CTGF as a cardioprotectant). I samarbeid med INVEN2 ble det startet et kommersialiseringsprosjekt som mottok FORNY-midler fra Norges Forskningsråd og også Innovasjonsmidler fra Helse Sør-Øst. Verifiseringsprosjektene gav imidlertid ikke resultater som ledet til videre kommersialisering på dette tidspunkt. En hovedutfordring var sannsynligvis fallende aktivitet til CTGF/CCN2 ved oppskalering av produksjon av rekombinant protein. Vår konklusjon er at vi må finne en småmolekylær forbindelse med agonist-virkningen til CTGF/CCN2 før man kan gå videre i utvikling av dette prinsippet som ny farmakologisk behandling for å redusere utbredning av myokardskade ved akutt hjerteinfarkt.

I dette prosjektet har vi vist at genmodifiserte mus med forhøyede nivåer av CCN2/CTGF i hjertet har økt toleranse for oksygenmangel i hjertet (økt toleranse for ischemi/reperfusjonsskade). Disse forsøkene ledet deretter til studier av perfunderte hjerter ex vivo der vi viste at hjerter perfundert med rekombinant CCN2/CTGF også har økt toleranse for ischemi/reperfusjonsskade. Rekombinant CCN2/CTGF økte toleransen for ischemi/reperfusjonsskade både når CCN2/CTGF ble administrert før ischemiperioden og når CCN2/CTGF ble administrert etter ischemiperioden ved begynnelsen av reperfusjonsfasen. Det siste er en forutsetning for at den beskyttende virkningen av CCN2/CTGF skal ha relevans til den kliniske, terapeutiske situasjonen der pasienter med akutt hjerteinfarkt blir innlagt til revaskularisering med PCI (percutan coronarintervensjon). Det er stor klinisk interesse for å finne farmakologisk behandling som kan administreres umiddelbart etter åpning av den trombotiserte koronararterien og bidra til å redusere infarktstørrelsen. Disse forsøkene ledet til patentsøknad i samarbeid med INVEN2 AS for å beskytte utnyttelsen av denne oppdagelsen som mulig nytt behandlingsprinsipp for å redusere tap av hjertemuskelvev ved akutt hjerteinfarkt. I 2013 har vi fullført studier der dette prinsippet har blitt testet i en stordyrmodell på gris utsatt for transient okklusjon av venstre koronararterie. Forsøkene på gris som har fått koronar-infusjon av rekombinant CCN2/CTGF umiddelbart etter ischemi-perioden, har imidlertid ikke vist signifikant reduksjon av infarktstørrelse. Vi arbeider derfor nå med å finne småmolekylære CCN2/CTGF agonister som kan administreres over lengre tid og kanskje i høyere konsentrasjoner enn rekombinant CCN2/CTGF. Vi har i 2013 også rapportert resultater som viser at CCN2/CTGF hemmer patologisk hypertrofi av hjertet. Transgene mus med hjertemuskel-spesifikk overekspresjon av CCN2/CTGF eksponert for kronisk trykkoverbelastning av hjertet (etter eksperimentell konstriksjon av aorta) utviklet mindre myokardhypertrofi og mindre utvikling av dilatert cardiomyopathi og hjertesvikt. Vi viste at hemming av patologisk hypertrofi mekanistisk kan forklares ved at CCN2/CTGF hemmer NFAT-mediert hypertrofi av kardiomyocyttene. Vi rapporterte i 2013 også studier som avslører en annen ny virkningsmekanisme til CCN2/CTGF i hjertet. Vi har funnet at CCN2/CTGF øker aktiviteten til G protein-koblet receptor kinase-5 (GRK5) i kardiomyocytter, en kinase som fosforylerer beta-adrenerge receptorer og dermed nedsetter følsomheten for den inotrope og kronotrope virkningen av catecholaminer i hjertet, en slags beta-blokker mekanisme. Samtidig leder økt GRK5 aktivitet til ”switching ” av signalering til økt G-protein-uavhengig, beta-arrestin-avhengig signalering i hjertemuskelcellene. I studien viser vi at disse mekanismene reduserer patologisk remodellering av hjertet og forsinker utvikling av hjertesvikt i eksperimentelle modeller på mus. Dette er helt ny kunnskap som kan hjelpe til med utvikling ny og mer effektiv behandling mot hjertesvikt. Disse studiene var også grunnlag for doktoravhandlingen til Jørgen Gravning som han forsvarte i mai 2013.Midlene som har blitt bevilget i dette prosjektet, har blitt benyttet til å lønne en bioingeniør samt til å dekke løpende driftsutgifter (avl av forsøksdyr, kjemikalier og reagenser, analysesystemer, etc.). Prosjektet løp ut i 2013, men de siste resultatene forventes rapportert i løpet av 2015.

I dette prosjektet har vi vist at genmodifiserte mus med forhøyede nivåer av CCN2/CTGF i hjertet har økt toleranse for oksygenmangel i hjertet (økt toleranse for ischemi/reperfusjonsskade). Disse forsøkene ledet deretter til studier av perfunderte hjerter ex vivo der vi viste at hjerter perfundert med rekombinant CCN2/CTGF også har økt toleranse for ischemi/reperfusjonsskade. Rekombinant CCN2/CTGF økte toleransen for ischemi/reperfusjonsskade både når CCN2/CTGF ble administrert før ischemiperioden og når CCN2/CTGF ble administrert etter ischemiperioden ved begynnelsen av reperfusjonsfasen. Det siste er en forutsetning for at den beskyttende virkningen av CCN2/CTGF skal ha relevans til den kliniske, terapeutiske situasjonen der pasienter med akutt hjerteinfarkt blir innlagt til revaskularisering med PCI (percutan coronarintervensjon). Det er stor klinisk interesse for å finne farmakologisk behandling som kan administreres umiddelbart etter åpning av den trombotiserte koronararterien og bidra til å redusere infarktstørrelsen. Disse forsøkene ledet til patentsøknad i samarbeid med INVEN2 AS for å beskytte utnyttelsen av denne oppdagelsen som mulig nytt behandlingsprinsipp for å redusere tap av hjertemuskelvev ved akutt hjerteinfarkt. I 2013 har vi fullført studier der dette prinsippet har blitt testet i en stordyrmodell på gris utsatt for transient okklusjon av venstre koronararterie. Forsøkene på gris som har fått koronar-infusjon av rekombinant CCN2/CTGF umiddelbart etter ischemi-perioden, har imidlertid ikke vist signifikant reduksjon av infarktstørrelse. Vi arbeider derfor nå med å finne småmolekylære CCN2/CTGF agonister som kan administreres over lengre tid og kanskje i høyere konsentrasjoner enn rekombinant CCN2/CTGF.

Vi har i 2013 også rapportert resultater som viser at CCN2/CTGF hemmer patologisk hypertrofi av hjertet. Transgene mus med hjertemuskel-spesifikk overekspresjon av CCN2/CTGF eksponert for kronisk trykkoverbelastning av hjertet (etter eksperimentell konstriksjon av aorta) utviklet mindre myokardhypertrofi og mindre utvikling av dilatert cardiomyopathi og hjertesvikt. Vi viste at hemming av patologisk hypertrofi mekanistisk kan forklares ved at CCN2/CTGF hemmer NFAT-mediert hypertrofi av kardiomyocyttene.

Vi rapporterte i 2013 også studier som avslører en annen ny virkningsmekanisme til CCN2/CTGF i hjertet. Vi har funnet at CCN2/CTGF øker aktiviteten til G protein-koblet receptor kinase-5 (GRK5) i kardiomyocytter, en kinase som fosforylerer beta-adrenerge receptorer og dermed nedsetter følsomheten for den inotrope og kronotrope virkningen av catecholaminer i hjertet, en slags beta-blokker mekanisme. Samtidig leder økt GRK5 aktivitet til ”switching ” av signalering til økt G-protein-uavhengig, beta-arrestin-avhengig signalering i hjertemuskelcellene. I studien viser vi at disse mekanismene reduserer patologisk remodellering av hjertet og forsinker utvikling av hjertesvikt i eksperimentelle modeller på mus. Dette er helt ny kunnskap som kan hjelpe til med utvikling ny og mer effektiv behandling mot hjertesvikt. Disse studiene var også grunnlag for doktoravhandlingen til Jørgen Gravning som han forsvarte i mai 2013.

Midlene som har blitt bevilget i dette prosjektet, har blitt benyttet til å lønne en bioingeniør samt til å dekke løpende driftsutgifter (avl av forsøksdyr, kjemikalier og reagenser, analysesystemer, etc.). Prosjektet løp ut i 2013, men vi vil i 2014 rapportere de siste resultatene fra prosjektet.

Nivåene til proteinet CTGF i det normale hjertet er på grensen til målbarhet. Ved hjerteinfarkt og ved hjertesvikt skjer imidlertid en kraftig økning av CTGF-aktiviteten i hjertet. I dette prosjektet har vi vist at genmodifiserte mus med høyt uttrykk av CTGF i hjertet har økt toleranse for oksygenmangel (ischemi/reperfusjonsskade). Disse studiene ledet til undersøkelser med renset rekombinant CTGF protein. Tilførsel av rekombinant CTGF til isolerte hjerter ex vivo viste også at CTGF øker toleransen for oksygenmangel. Disse forsøkene ledet til patentsøknad i samarbeid med INVEN2 AS for å beskytte utnyttelsen av denne oppdagelsen som mulig behandlingsprinsipp for å redusere tap av hjertemuskelvev ved akutt hjerteinfarkt. For øyeblikket testes dette prinsippet på gris som utsettes for transient okklusjon av venstre koronararterie. Disse forsøkene utføres i samarbeid med Intervensjonssenteret, Oslo Universitetssykehus – Rikshospitalet og forventes fullført våren 2013.

I 2012 har vi fullført forsøk som viser at renset rekombinant CTGF virker direkte på isolerte hjertemuskelceller i cellekultur. Disse forsøkene har vist at CTGF aktiverer den intracellulære signalkaskaden PI3 kinase/Akt/GSK-3beta i hjertemuskelceller, en signalvei som tidligere har blitt vist å beskytte hjertet ved oksygenmangel. Ved undersøkelser av transkriptomet til isolerte hjertemuskelceller behandlet med og uten rekombinant CTGF ved hjelp av DNA mikromatrise-analyser, har vi bekreftet av CTGF induserer en rekke genprogrammer som potensielt kan beskytte hjertemuskelceller mot oksygenmangel og frie oksygenradikaler. Vi viste også at CTGF reduserer død av hjertemuskelceller som utsettes for en periode med hypoksi, d.v.s. dyrkningsbetingelser med 0.5% oksygen. Forsøkene viste også at CTGF reduserer celledød ved eksponering for cellegiften doxorubicin. En bivirking ved behandling med doxorubicin er i noen tilfeller toksisk virkning på hjertemuskelcellene og utvikling av hjertesvikt.

I 2012 har vi videre fullført forsøk som viser at CTGF beskytter mot utvikling av hjertesvikt i genmodifiserte mus. I samarbeid med forskere ved Stavanger Universitetssykehus har vi målt CTGF-nivåer hos pasienter som ble innlagt for ballongkateter-åpning av trombotisert kransarterie ved akutt hjerteinfarkt og relatert til infarkttilheling og hjertefunksjon ett år etter den akutte hendelsen. Disse undersøkelsene viste at pasienter som hadde økende nivåer av CTGF i den subakutte perioden etter hjerteinfarkt hadde mindre arrområde og bedre hjertefunksjon etter ett år sammenlinget med pasienter som ikke fikk økning av CTGF etter hjerteinfarkt. Det er kjent at det hos mennesker er polymorfismer i genet til CTGF som kan påvirke nivået i sirkulerende blod, men hvorvidt slike polymorfismer har betydning ved hjerteinfarkt og hjertesvikt er ukjent. Dette er imidlertid forsøk som vi er igang med å utføre i samarbeid med forskere ved Oslo Universitetssykehus – Ullevål.

I 2012 har vi også fullført studier som viser at CTGF hemmer utvikling av hypertrofi av hjertemuskelen ved hjertesvikt. Hypertrofi av hjertemuskelen er en kompensatorisk mekanisme ved tap av hjertemuskelkraft, som samtidig predisponerer for arrytmier og økt bindvevsdannelse i hjertet. Vi har vist at CTGF hemmer transkripsjonsfaktoren NFAT, men foreløpig gjenstår undersøkelser av hvordan NFAT-aktiviteteen blir hemmet.

Midlene som ble bevilget for 2012, har blitt benyttet til å lønne en bioingeniør samt til å dekke løpende driftsutgifter (oppstalling av forsøksdyr, kjemikalier og reagenser, analysesystemer, etc.). Resultatene som er beskrevet ovenfor, er tildels publisert i 2 vitenskapelige originalarbeider i 2012 og tildels under bearbeidelse for publisering.

Formålet med dette prosjektet er å undersøke om rekombinant CCN2/CTGF administrert direkte i koronarkretsløpet øker hjertets toleranse mot ischemi/reperfusjonsskade og således reduserer infarktstørrelse. Hvis så er tilfelle, vil vi forsøke å avklare mekanismene til den kardioprotektive virkningen av CCN2/CTGF. I 2011 har vi fått følgende nye resultater:

1. Rekombinant human CCN2/CTGF reduserer infarktstørrelse etter ischemi/reperfusjon i ex vivo perfunderte hjerter fra mus (Langendorff-perfunderte hjerter). Rekombinant CCN2/CTGF reduserer infarktstørrelse både ved administrering av CCN2/CTGF før ischemi så vel som ved administering umiddelbart etter ischemi.

2. Rekombinant human CCN2/CTGF beskytter også adulte kardiomyocytter fra mus eksponert for hypoxi/reoksygenering.

3. Den kardioprotektive og cytoprotektive virkningen av CCN2/CTGF er knyttet til aktivering av fosfokinase-kaskaden PI3 kinase/AKT/GSK-3beta. Farmakologisk hemming av PI3 kinase eller AKT aktivitet eliminerte den protektive virkningen til CCN2/CTGF. Den protektive virkingen til CCN2/CTGF synes å utøves ved direkte virkning på kardiomyocyttene. PI3 kinase/AKT/GSK-3ß signalveien er kjent å virke beskyttende på mitokondriefunksjon, og vi arbeider nå med direkte funksjonsanalyser (oksygen forbruk/oksygen-reservekapasitet) av mitokondriefunksjon. Vi vil således avklare om denne raskt innsettende, protektive virkning til CCN2/CTGF er knyttet til direkte signalering til mitokondrier og hemming av ”mitochondrial transition pore”-kanalen.

4. Analyse av serum-CCN2/CTGF nivåer i en kohorte av pasienter med akutt ST-elevasjon hjerteinfarkt innlagt på sykehus for revaskularisering med PCI – perkutan koronar intervensjon, viste at pasienter som fikk en øking av serum-CCN2/CTGF nivåene i de første 3 månedene etter infarktet, hadde signifikant bedre hjertefunksjon 12 måneder etter infarktet målt med funksjonell MR, enn pasienter som ikke viste økning av serum-CCN2/CTGF etter hjerteinfarkt. Infarkttilheling var også bedre i gruppen som viste økning i serum-CTGF nivåene. Denne studien ble utført i samarbeid med Dr. Stein Ørn og professor Kenneth Dickstein ved Stavanger Universitetssykehus. Disse dataene er konsistente med de dyreeksperimentelle data som viser at økning av CCN2/CTGF aktivitet virker kardioprotektivt.

Den potensielle anvendelsen av rekombinant human CCN2/CTGF som adjuvant behandling til PCI og revaskularisering av pasienter med akutt hjerteinfarkt for å redusere ischemi/reperfusjonsskade og utbredelse av hjerteinfarkt, er søkt patentbeskyttet i samarbeid med INVEN2 AS (tidligere Birkeland Innovasjon AS), Universitetet i Oslo. Som ledd i arbeidet med å verifisere denne oppdagelsen, skal vi i 2012 også undersøke den kardioprotektive virkningen til CCN2/CTGF på griser med transient okklusjon av venstre koronararterie og dermed induksjon av ischemi/reperfusjonsskade. Rekombinant CCN2/CTGF vil bli administrert via kateteret i venstre koronararterie i forbindelse med revaskulariseringen for å simulere sitasjonen hos pasienter med akutte koronarsyndromer som behandles med ballongdilatasjon av trombose i ve. koronararterie. Infarktstørrelse vil bli undersøkt både med MR-undersøkelse med gadolinium kontrast og ved farging av myokardvev med TTC (histokjemisk viabilitetsfarge) etter avslutning av forsøket. Dette delprosjektet som utføres i samarbeid med Intervensjonssenteret, Oslo Universitetssykehus HF, er nå startet opp og skal fullføres innen utgangen av 2012.

Vi har tidligere vist at CCN2/CTGF (connective tissue growth factor) blir utskilt fra hjertemuskelceller og bindevevsceller ved hjertesvikt. CCN2/CTGF er kjent som et matricellulært protein, d.v.s. et protein som regulerer cellefunksjon ved interaksjon med andre proteiner i ekstracellulær matriks. En receptor for CCN2/CTGF på celleoverflaten er imidlertid enda ikke blitt identifisert og karakterisert. Det kan likevel ikke utelukkes at CTGF binder spesifikke receptorer på celleoverflaten og leder signaler direkte gjennom cellemembranen. Forhøyede nivåer av CTGF i vev er ofte assosiert med tilstander med økt kollagenproduksjon. Det har derimot vært ukjent om CCN2/CTGF alene kan stimulere til økt bindevevsdannelse, f.eks. i hjertet. Vi har etablert genmodifiserte mus med hjertemuskel-spesifikk overuttrykk av CTGF. Disse musene har helt minimal økning av kollagen i hjertet (ca. 20% økning) og ingen endring av hjertefunskjon. Derimot har vi funnet at CCN2/CTGF har en markert kardioprotektiv virkning både mot ischemi/reperfusjonsskade og mot utvikling av hjertesvikt. Dette er en helt ny og overraskende virkning av CTGF som ble oppdaget i vårt laboratorium. Formålet med dette prosjektet er således å karakterisere mekanismene til den kardioprotektive virkningen til CCN2 og om det kan være mulig å benytte dette prinsippet til å redusere infarktstørrelse i dyreeksperimentelle modeller med ischemi/reperfusjonsskade. Idéen er også videreutviklet i samarbeid med Birkeland Innovasjon/Inven2 AS som har søkt om patentsbeskyttelse av mulig anvendelse av CCN2/CTGF som infarktreduserende behandling hos pasienter med akutt hjerteinfarkt som kommer til behandling med ballonkateterisering (perkutan coronar intervensjon) og gjenåpning av coronar-sirkulasjon. Vi etablert system for produksjon og rensing av rekombinant human-CCN2/CTGF og arbeider for øyeblikket med undersøkelser av hvorledes CCN2/CTGF hemmer infarktutvikling i mus som får administrert CCN2/CTGF intravenøst ved tidspunkt for reperfusjon etter ischemi. Vi har også vist at økning av CCN2/CTGF i serum hos pasienter med akutt hjerteinfarkt (STEMI-pasienter som innlegges for ballongkateterisering og gjenåpning av sirkulasjon) er assossiert med bedret infarkttilheling og redusert venstre ventrikkel remodellering 12 måneder etter infarktet. Foreløpige data indikerer at CCN2/CTGF reduserer infarktstørrelse på mus etter ischemi/reperfusjonsskade. Liknende forsøk vil også bli utført på griser som utsettes for transient ischemi av hjertet. I tillegg arbeider vi med hvordan CCN2/CTGF initierer intracellulære signalveier. Vi har vist at CTGF fosforylerer og aktiverer Akt (økning av phospho-Akt473) med følgende forsforylering og hemming av glycogen synthetase-3beta (GSK-3beta). Denne signalvien er kjent å virke beskyttende på mitokondriefunksjon, og vi arbeider nå med direkte funksjonsanalyser (oksygen forbruk) av mitokondriefunksjon. Vi har også vist at denne signalveien aktiverer antiapoptotisk genekspresjon og leder til økning av scavengere av frie oksygen radikaler. Nye genmodifiserte mus som muliggjør aktivering av CCN2/CTGF i hjertet på definerte tidspunkter er også under etablering og vil benyttes til å avklare funksjon til CCN2 under remodellering av myokard etter hjerteinfarkt og ved utvikling av hjertesvikt.

Prosjektet er et 3-årig forskningsprosjekt støttet av Helse Sør-Øst. I 2009 har vi verifisert den kardioprotektive virkningen av CCN2/CTGF opprinnelig observert i transgene mus med hjertemuskel-spesifikt uttrykk av CCN2/CTGF. I normale hjerter perfundert ex vivo (Langendorff-perfuson) fant vi at rekombinant CCN2/CTGF tilsatt i perfusjonsbuffer i forbindelse med reperfusjonsfasen etter ischemi, reduserte infarktstørrelse. Virkningen av rekombinant CCN2/CTGF i perfunderte hjerter ex vivo var imidlertid ikke like markant som i hjerter fra transgene (Tg) CCN2/CTGF mus. Vi har imidlertid bekreftet at rekombinant CCN2/CTGF aktiverer samme signalveier som de som ble funnet aktivert i Tg-CCN2/CTGF mus, d.v.s. rekombinant CCN2/CTGF stimulerer fosforylering av AKT/GSK-3beta signalveien i hjertemuskelcellene. Vi har også vist at rekombinant CCN2/CTGF beskytter isolerte hjertemuskelceller mot apotose og celledød ved hypoksi i cellekammer (1% O2, 5% CO2; 94% N2) med etterfølgende reoksygenering. Dermed synes det klart at hjertemuskelcellene er målceller for CCN2/CTGF. Den mer uttalte protektive virkningen av CCN2/CTGF i Tg-CCN2/CTGF mus kan imidlertid være resultat av langtidsvirkning CCN2/CTGF med induksjon av et kardioprotektivt genprogram. Analyse av genom-omfattende myokardial genekspresjon i hjerter fra Tg-CTGF mus sammenlignet med hjerter fra nontransgene kontrollmus ved hjelp av DNA mikromatrise, viste at hjerter fra Tg-CCN2/CTGF mus uttrykker et kardioprotektivt genekspresjons-program. Full kardioprotektiv funksjon av CCN2/CTGF krever derfor virkning over tilstrekkelig lang tid til å aktivere det kardioprotektive genprogrammet, d.v.s. et tidsperspektiv som går utover tidsrammen for analyse av hjertet ex vivo ved Langendorff-perfusjon. For å bekrefte denne hypotesen har vi i 2009 etablert en ny transgen modell i mus som muliggjør tidsbestemt (”conditional”) induksjon av CCN2/CTGF ved hjelp av en induserbar promotor. Kort fortalt har vi etablert transgene hybrider som muliggjør hjerte-spesifikk induksjon av CCN2/CTGF med en doxycyclin-induserbar transaktivator som styrer CCN2/CTGF i hjertemuskelcellene. Denne modellen er nå ferdig etablert og vil bli vårt viktigste prosjekt i 2010. I denne musemodellen kan vi indusere CCN2/CTGF over forskjellige tidsintervaller og dermed studere betydningen av den umiddelbare fosfokinase signalkaskaden versus langtidsvirkningene av CCN2/CTGF i hjertet. I henhold til prosjektplanen, skal vi også studere hvilken rolle CCN2/CTGF spiller ved utvikling av hjertesvikt, f.eks. ved kronisk trykkoverbelastning etter eksperimentell aortakonstriksjon. I disse forsøkene vil vi benytte den nye transgene modellen med induserbar ekspresjon av CCN2/CTGF i hjertet.

Den kardioprotektive virkningen av CCN2/CTGF er søkt patentbeskyttet i samarbeid med Birkeland Innovasjon AS, Universitetet i Oslo. Som ledd i arbeidet med å verifisere denne oppdagelsen, skal vi i 2010 også undersøke kan kardioprotektive virkningen til CCN2/CTGF på griser med transient okklusjon av venstre koronararterie og dermed induksjon av ischemi/reperfusjonsskade. Rekombinant CCN2/CTGF vil bli administrert via kateteret i venstre koronararterie i forbindelse med revaskulariseringen for å simulere sitasjonen hos pasienter med akutte koronarsyndromer som behandles med ballondilatasjon av trombose i ve. koronararterie. Infarktstørrelse vil bli undersøkt både med MR-undersøkelse og ved farging av myokardvev med TTC(histokjemisk viabilitetsfarge).