A mouse model for in vivo imaging of a DNA repair and tumor suppressor protein
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 2010045
- Ansvarlig person
- Liv Kleppa
- Institusjon
- Oslo universitetssykehus HF
- Prosjektkategori
- Korttidsstipend, for fullføring av dr. grad
- Helsekategori
- Generic Health Relevance
- Forskningsaktivitet
- 1. Underpinning
Rapporter
Kreft er en av de ledende dødsårsakene i verden. I kreftceller ser man at det hoper det seg opp mutasjoner i onkogener, tumor suppressor gener og gener som koder for DNA reparasjonsproteiner.I prosjektet beskrevet her har vi sett nærmere på et protein som er viktig for å unngå feil i DNAet, enzymet strukturspesifikk flap endonuklease 1 (Fen1). Fen1 er viktig både når cellene skal replikere DNA, og i baseutkuttingsreparasjon (BER) hvor flap-DNA må fjernes som en del av prosessen. Nylig publiserte studier presenterer Fen1 som et tumor suppressor protein.
Vi laget et fusjonsprotein, der Fen1 er tagget med fluorescerende YFP (yellow fluorescent protein) og His6- og HA-tagger til bruk ved rensing og deteksjon av fusjonsproteinet. Ved hjelp av homolog rekombinasjon i ES-celler ble Fen1 allelet byttet ut med Fen1-YFP, og knock-in mus produsert. Vi viser at ekspresjonen av Fen1-YFP proteinet i knock-in mus er som i villtype Fen1 mus, både i fibroblastcellelinje fra Fen1-YFP knock-in mus og i ulikt vev, som milt, thymus, testikler og lunge (vist med western blot analyse av totalcelleekstrakt med antistoff mot Fen1, kvantitativ real-time PCR, immunofarging). Særlig er uttrykket av Fen1 høyt i prolifererende celler og vev, vist med Ki-67 farging (proliferasjonsmarkør) av celler. Dette er i samsvar med Fen1’s rolle i DNA replikasjon.
Fen1-YFP viser lokalisering til cellekjernen, og ble visualisert både in vivo og med immunfarging av vevssnitt og celler. Visualisering av Fen1-YFP i levende celler og immunfargede celler og vev ble gjort i samarbeid med professor Giglia-Mari og hennes gruppe ved CNRS i Toulouse (Multifoton mikroskopi, Zeiss LSM 710), og Professor Vermeulen og hans gruppe ved Erasmus University Medical Center (Konfokal (Zeiss LSM 510) mikroskopi), og i vår egen lab (Konfokal (Zeiss LSM 510) og fluorescens mikroskopi).
Ved bruk av multifoton mikroskop med 800nm laser skadet vi DNA i celler fra Fen1-YFP knock-in mus i en avgrenset del av cellekjernen, og så på akkumulering av Fen1-YFP til det skadede området. Etter ca 2 minutter nådde fluorescensen maksimum intensitet, da var det høyest Fen1-YFP proteinakkumulering i området med skadet DNA. Dette er i samsvar med studier av andre BER-proteiners rekruttering til DNA skade, særlig under enkeltrådbruddreparasjon. Vi gjorde også FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)-målinger etter lokal skade som følge av multifotonlaser og global kjemisk indusert (MMS, H202, KBrO3) DNA-skade på Fen1-YFP knock-in cellene. Fen-YFP akkumulerer raskt (synlig innen omtrent 10-30 sekunder) til skadet DNA (hovedsaklig enkeltrådbrudd og baseskader), og Fen1-YFP proteinet er også raskt til å dissosiere av og på DNA-substratet sitt.
Parp er et protein som er kjent for å komme raskt til trådbrudd i DNA, som ribosylerer seg selv og andre proteiner, og som rekrutterer reparasjonsproteiner. Vi inhiberte Parp i Fen1-YFP knock-in celler (med DPQ Parp-inhibitor), og så at Fen1-YFP ble sterkt forhindret i å samle seg på lokalt skadet laserbestrålt DNA. Dette indikerer at Fen1 trenger Parp for å komme raskt til substratet sitt og reparere skadet DNA.
I levende hud- og hjernevev fra mus, som ble mikroskopert innen 2 timer etter uttak fra Fen1-YFP knock-in mus, kunne vi se høy Fen1-YFP ekspresjon i keratinocytter i hudvev, og høy Fen1-YFP mobilitet etter laserindusert (multifoton, 800nm) DNA-skade. I hjerne var det få celler med Fen-YFP ekspresjon, i samsvar med at det finnes færre prolifererende celler i hjernevev.
Til oppsummering har vi laget og karakterisert en knock-in musemodell, der fluorescensmerket Fen1 DNA reparasjons- og tumor suppressor protein ble visualisert i levende celler og vev under fysiologiske forhold. FRAP multifotonmikroskopstudier viste at proteinmobiliteten var høy, Fen1 binding til og dissosiering fra skadet DNA er rask. Fen1 trenger Parp for rask rekruttering til DNA med trådbrudd. Fen1-YFP musemodellen, med høyt uttrykk av Fen1 i prolifererende celler kan vise seg å være et nyttig verktøy i fremtidige studier av kreftutvikling, og mulig kryssing med (annet fluorescencsfarget knock-in protein eller nullmutant) musemodeller for andre DNA reparasjonsproteiner for studier av proteinfunksjoner og –interaksjoner.
Kreft er en av de ledende dødsårsakene i verden. I kreftceller ser man at det hoper det seg opp mutasjoner i onkogener, tumor suppressor gener og gener som koder for DNA reparasjonsproteiner.I prosjektet beskrevet her har vi sett nærmere på et protein som er viktig for å unngå feil i DNAet, enzymet strukturspesifikk flap endonuklease 1 (Fen1). Fen1 er viktig både når cellene skal replikere DNA, og i baseutkuttingsreparasjon (BER) hvor flap-DNA må fjernes som en del av prosessen. Nylig publiserte studier presenterer Fen1 som et tumor suppressor protein.
Vi laget et fusjonsprotein, der Fen1 er tagget med fluorescerende YFP (yellow fluorescent protein) og His6- og HA-tagger til bruk ved rensing og deteksjon av fusjonsproteinet. Ved hjelp av homolog rekombinasjon i ES-celler ble Fen1 allelet byttet ut med Fen1-YFP, og knock-in mus produsert. Vi viser at ekspresjonen av Fen1-YFP proteinet i knock-in mus er som i villtype Fen1 mus, både i fibroblastcellelinje fra Fen1-YFP knock-in mus og i ulikt vev, som milt, thymus, testikler og lunge (vist med western blot analyse av totalcelleekstrakt med antistoff mot Fen1, kvantitativ real-time PCR, immunofarging). Særlig er uttrykket av Fen1 høyt i prolifererende celler og vev, vist med Ki-67 farging (proliferasjonsmarkør) av celler. Dette er i samsvar med Fen1’s rolle i DNA replikasjon.
Fen1-YFP viser lokalisering til cellekjernen, og ble visualisert både in vivo og med immunfarging av vevssnitt og celler. Visualisering av Fen1-YFP i levende celler og immunfargede celler og vev ble gjort i samarbeid med professor Giglia-Mari og hennes gruppe ved CNRS i Toulouse (Multifoton mikroskopi, Zeiss LSM 710), og Professor Vermeulen og hans gruppe ved Erasmus University Medical Center (Konfokal (Zeiss LSM 510) mikroskopi), og i vår egen lab (Konfokal (Zeiss LSM 510) og fluorescens mikroskopi).
Ved bruk av multifoton mikroskop med 800nm laser skadet vi DNA i celler fra Fen1-YFP knock-in mus i en avgrenset del av cellekjernen, og så på akkumulering av Fen1-YFP til det skadede området. Etter ca 2 minutter nådde fluorescensen maksimum intensitet, da var det høyest Fen1-YFP proteinakkumulering i området med skadet DNA. Dette er i samsvar med studier av andre BER-proteiners rekruttering til DNA skade, særlig under enkeltrådbruddreparasjon. Vi gjorde også FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)-målinger etter lokal skade som følge av multifotonlaser og global kjemisk indusert (MMS, H202, KBrO3) DNA-skade på Fen1-YFP knock-in cellene. Fen-YFP akkumulerer raskt (synlig innen omtrent 10-30 sekunder) til skadet DNA (hovedsaklig enkeltrådbrudd og baseskader), og Fen1-YFP proteinet er også raskt til å dissosiere av og på DNA-substratet sitt.
Parp er et protein som er kjent for å komme raskt til trådbrudd i DNA, som ribosylerer seg selv og andre proteiner, og som rekrutterer reparasjonsproteiner. Vi inhiberte Parp i Fen1-YFP knock-in celler (med DPQ Parp-inhibitor), og så at Fen1-YFP ble sterkt forhindret i å samle seg på lokalt skadet laserbestrålt DNA. Dette indikerer at Fen1 trenger Parp for å komme raskt til substratet sitt og reparere skadet DNA.
I levende hud- og hjernevev fra mus, som ble mikroskopert innen 2 timer etter uttak fra Fen1-YFP knock-in mus, kunne vi se høy Fen1-YFP ekspresjon i keratinocytter i hudvev, og høy Fen1-YFP mobilitet etter laserindusert (multifoton, 800nm) DNA-skade. I hjerne var det færre celler med Fen-YFP ekspresjon, i samsvar med at det finnes færre prolifererende celler i hjernevev.
Til oppsummering har vi laget og karakterisert en knock-in musemodell, der fluorescensmerket Fen1 DNA reparasjons- og tumor suppressor protein ble visualisert i levende celler og vev under fysiologiske forhold. FRAP multifotonmikroskopstudier viste at proteinmobiliteten var høy, Fen1 binding til og dissosiering fra skadet DNA er rask. Fen1 trenger Parp for rask rekruttering til DNA med trådbrudd. Fen1-YFP musemodellen, med høyt uttrykk av Fen1 i prolifererende celler kan vise seg å være et nyttig verktøy i fremtidige studier av kreftutvikling, og mulig kryssing med (annet fluorescencsfarget knock-in protein eller nullmutant) musemodeller for andre DNA reparasjonsproteiner for studier av proteinfunksjoner og –interaksjoner.
Vitenskapelige artikler
Kleppa L, Mari PO, Larsen E, Lien GF, Godon C, Theil AF, Nesse GJ, Wiksen H, Vermeulen W, Giglia-Mari G, Klungland A
In vivo kinetics and PARP1 dependence of FEN1 in base excision repair
Submitted,under revision
Kleppa L, Mari PO, Flor Lien G, Godon C, Theil A, Nesse GJ, Vermeulen W, Larsen E, Giglia-Mari G and Klungland A.
In vivo kinetics and Parp dependence of Fen1 in base excision repair.
Manuscript in preparation
Doktorgrader
Liv Kleppa
Excision repair deficiencies in man and mice; lessons from CSA and Fen1 mutants
- Disputert:
- desember 2011
- Hovedveileder:
- Arne Klungland
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til eRapport