Treating blindness using novel tissue storage technology

Forskergruppen har tidligere som den første i verden etablert utstyr og metode for lagring av limbale epiteliale celler. Stamcellesvikt i øyets overflate skyldes en rekke tilstander, fra skader, kroniske infeksjoner eller medfødte sykdommer som aniridi. Pluripotente stamceller som kan differensiere videre til hornhinne-epitelceller ligger i overgangssonen mellom hornhinnen (cornea) og bindevevshinnen (konjunktiva); et område kalt limbus. Når stamcellene blir ødelagt kan ikke det ytre epitelet i hornhinnen nydannes. Resultatet blir stadig tilbakevennende sår, betennelse og arrvev i hornhinnen, som gir smerter og dårlig syn. For disse pasientene fungerer ikke konvensjonell hornhinnetransplantasjon. Enkelte kan imidlertid behandles med en metode første gang publisert av Pellegrini et al i Lancet 1997. Metoden innebærer høsting av en ca 1-3 x 3 millimeter bit fra et friskt område av limbus, som festes på en fosterhinne og dyrkes i organkulturmedium i 2- 3 uker. Fosterhinnen dekkes med limbale epiteliale celler med en høy andel umodne celler, som etter dyrkning transplanteres tilbake til pasientens syke øye. På denne måten kan stamcellepopulasjonen re-etableres, hornhinneepitelet tilheles og synet forbedres. På Oslo Universitetssykehus Ullevål ble transplantasjon av ex vivo ekspanderte limbale epiteliale celler startet opp i 2007. Det er behov for forskning på hvordan metoden kan gjøres tryggere og mer tilgjengelig. Vi har samarbeidet med en gruppe forskere i Barcelona ved en øyeklinikk som blant annet hyppig utfører hornhinnetransplantasjoner hvor donorvev fra avdøde benyttes. Limbalt vev har etter informert samtykke fra pårørende blitt sendt til Oslo Universitetssykehus, og vi har derfor hatt anledning til å designe og utføre sammenlignende, ikke-kliniske eksperimenter: 1) Vi har sammenlignet dyrkning fra limbalbiter med ulik størrelse (1x3mm og 3x3 mm) for å finne minste mulige størrelse for å unngå å utsette pasienten for unødig risiko ved høsting av limbalt vev (infeksjonsrisiko, risiko for lege-indusert limbal stamcellesvikt i det friske øyet) Resultat: Dataene er ennå ikke publisert, men vi har funnet at minste størrelse (1x3 ) mm gir like god vekst som største størrelse (3x3mm). 2) Vi har utført eksperimenter der vi har lagret limbalt epitelialt vev på fosterhinne under varierende temperaturer og lagringsmedier. Resultat: Vi har funnet at 23 grader celsius er egnet temperatur for limbale celler og at HEPES-MEM med tilsetning av antibiotika (gentamicin og amphotericin) var et optimalt lagringsmedium. 3) Vi har simulert transportsituasjoner ved bruk av en ristemaskin forut for lagring av limbalt epitelialt vev, for å se hvordan vevet tåler transport, og hvilke transportbetingelser som er de minst skadelige for vevet. Resultat: Vi fant at vevet kunne transporteres i 36 timer under kraftig risting (220rpm) med intakte, levende cellelag uten endring av phenotype dersom flaskene var fylt til randen med medium. Studien har til nå resultert i 3 artikler hvor av de to første er publisert og den siste er ferdig skrevet. Disse vil inngå i en PhD-avhandling hvor alle artikler foreligger og hvor arbeidet med sammenskrivning er i gang, og vil bli ferdig innen to måneder. Innen året vil PhD-graden avlegges. Det er materiale for ytterligere en artikkel som ikke er skrevet ferdig ennå. Som en spin-off av det omfattende arbeidet med epiteliale celler i øyets overflate har gruppen opparbeidet seg forskningskompetanse også innen tørre øyne og sykdommer som rammer øyets overflatte. Forskergruppen deltar nå i samarbeid med andre grupper om to kliniske studier av henholdsvis pasienter med Sjøgren og aniridi. En artikkel er publisert med kandidaten som medforfatter (Aqrawi et al 2017) og en er submittert med kandidat som medforfatter: Landsend et al. Dry Eye Disease in Aniridia. Helsetjenesten kan dra nytte av forskningsresultatene til dette prosjektet i form av at dyrkede limbale epitheliale celler kan lagres i romtemperatur i 4 dager forut for kirurgi. Dette tidsrommet er tilstrekkelig til at kirurgi kan planlegges bedre og mulliggjør kvalitetssikring av de dyrkede limbale cellene. F.eks. kan man dyrke en prøve fra lagringsmediet for å unngå å transplantere infisert materiale. På sikt kan man også finne metoder for vurdering av grad av umodenhet av celler i 4-dagersintervallet, som er den viktigste parameteren for kvaliteten på transplantatet. Vi vet også at det trengs et svært lite område av limbus for å oppnå et godt dyrkningsresultat (kun 1x1 mm), og unngår derfor å fjerne et for stort område av friskt vev når vi skal høste for dyrkning. Vi har også funnet ut at cellene kan lagres serumfritt, og dermed unngås risiko for smitteoverføring fra dyr til mennesker, siden kalveserum normalt benyttes icelledyrkning. Sist har vi funnet at den viktigste parameteren for kvaliteten på transplantatet; antallet umodne celler; ikke påvirkes av de ulike lagringsmediene som ble benyttet, og holder seg over tid også ut over 7 dager. Vi har også fremstilt en metode for hvordan dyrkede limbale celler kan utholde kraftig risting i 36 timer, noe som åpner opp for transport av cellene. Vi har funnet praktiske detaljer for transportering, f.eks. at man bør la de dyrkede cellene bli værende på membranen de er dyrket på under transport, og at membrane bør henge fritt fra korken og være fullstendig dekket med medium for å beskytte cellene, og at en stor mengde medium (47 mL) er fordelaktig. Samlet vil resultatene fra studien kunne anvendes til en betydelig tryggere kjede for framstilling av limbale celler til bruk ved limbal stamcelletransplantasjon, hvor infeksjon og mislykkede forsøk på transplantasjon kan reduseres. Samtidig gjør vi metoden mer praktisk anvendbar i form av at kirurgi kan planlegges og at man åpner opp for produksjon av celler på et sentralt laboratorium med ekspertise og førsteklasses utstyr, for deretter å sendes f.eks. med fly til øyeklinikken som behandler pasientene. I tråd med målene for studien har vi bidratt til å gjøre metoden med transplantasjon av limbale celler tryggere og mer tilgjengelig.