HISTOLOGICAL CHARACTERIZATION OF THE BONE REMODELING COMPARTMENT AND ITS INVOLVEMENT IN BONE MARROW LESION AND SKELETAL METASTASES

Benmargslesjoner er karakterisert av en sterk økning i benomsetning og kardannelseBenmargslesjoner (BML) er forandringer i benvev som kan sees kun ved MR-undersøkselse. De forekommer hyppig ved ulike muskelskjelettsykdommer som for eksempel slitasjegikt og leddgikt samt ved kreft med spredning til ben, og ikke minst ved traumer.Dette er en klinisk relevant studie på benmargslesjoner hos pasienter med slitasjegikt. Pasientene var allerede henvist til sykehuset for å få hofteleddsprotesr på grunn av avansert sykdom i leddet som førte til smerte og nedsatt funksjon. Pasientene gikk gjennom en rutineutredning med røntgen og blodprøver. De som samtykket til å delta i studien ble undersøkt med MR før operasjonen. De fikk i tillegg fire doser med tetracyklin for at bendannelsen senere skulle kunne studeres under fluorescensmikroskop. Hofteben som var fjernet under operasjonen ble oppbevart for videre behandling og analyse. Deler av hofteben fra hver pasien ble behandlet for å framstille tynne snitt som kunne studeres under mikroskopet. Metoden besto av systematisk måling av parametre forbundet med bennydannelse og størrelsen til mikroskopiske benstrukturer. Resultatene viste at benomsetningen var økt kraftig i benvev med BML. Videre ble kardannelse studert i benprøvene og sammenlignet med prøver som ikke hadde BML. En ny metode ble utviklet for å kunne kvantitere karmengde i benmargen. Protokollen benyttet spesifikk farging av to proteiner i karvegg. Den ble kvalitetssikret gjennom omfattende testing av validitet og reproduserbarhet, og deretter brukt for å sammenligne karmengde i ben med og uten BML. Resultatene viste en kraftig økning av ny kardannelse i det syke benet. Det er første gang at dette har blitt vist på sykt benvev med BML. Funnene våre har potensielt betydning for behandling av pasienter med langtkommen slitasjegikt som ofte blir invalidisert på grunn av store smerter, og eventuelt for andre bensykdommer hvor BML forekommer.

Benmargslesjoner er karakterisert av høy benremodellering og økt vaskulariseringBenmargslesjoner er patologiske forandringer i ben og benmarg som sees ved MR-undersøkelse og forekommer ved flere inflammatoriske og degenerative tilstander som rammer muskelskjellett systemet. Osteoartritt og revmatoid artritt er blant sykdommer der man ser benmargslesjoner. Vi har studert ben fra pasienter som har avansert osteoartritt.Benmargslesjoner kan ikke sees ved vanlige røntgenundersøkelser, men sees som økt vannsignal på spesifikke MR-undersøkelser. De mikroskopiske og cellulære forandringene som ligger til grunn for denne sykdomstilstanden har vært lite kjent til nå. Tidligere histologiske studier kunne ikke vise til typiske tegn til væskeansamling i benmargen slik MR-bilder antyder. Den kliniske viktigheten av benmargslesjoner som markør for smerte og sykdommens sannsynlige forløp ved revmatologiske tilstander har blitt understreket av flere kliniske og radiologiske studier i nyere tid. Likevel er det få som har undersøkt histopatologiske karakteristika ved benmargslesjoner på cellenivå. Fravær av observasjon av ødem, og heller tvetydige funn av inflammatoriske celler, fibrose, abnorm mineralisering, nekrose og lokalt vevssvinn tydet på manglende kunnskap, noe som dannet utgangspunkt for dette prosjektet. Arbeidshypotesen var at benmargslesjoner er kjennetegnet av typiske karakteristika på reparative prosesser slik som i resten av kroppen, og at de kan inneholde forhøyede mengder med karvev for å underbygge tilheling av vevet. For å studere benmargslesjoner ble det rekrutert patienter med avansert osteoartritt som var henvist til Martina Hansen sykehus for å få hofteleddsprotese. Typiske kliniske tegn for disse pasientene var kronisk smerte og nedsatt bevegelighet og funksjon i hofteleddet. Det ble rekruttert 30 pasienter etter bestemte kriterier. Alle fikk skriftilig og muntlig informasjon og deretter samtykket til å delta i prosjektet. MR-undersøkelse av disse pasientene viste at tre fjerdedeler hadde forandringer i lårbenshode som var forenlige med benmargslesjoner. En fjerdedel hadde ikke disse forandringene og fungerte dermed som kontroller. For å kunne gjøre de mikroskopiske undersøkelsene ble det tatt ut benprøver fra lårbenshoder som var allerede fjernet under proteseoperasjonen. Disse prøvene ble behandlet og preparert til tynne mikroskopsnitt før de ble farget med en spesiell metode for å kunne skjelne ben, marg og de forskjellige cellene under analysen. Data fra analysene viste at sammenlignet med kontroller, haddde ben med benmargslesjon en uttalt forhøyning av benremodellering. Det vil si at det normale tempet til benfornyelsen hadde mer enn tredoblet seg. Videre kunne man se en tidobling av mengde karvev i den syke benmargen. Disse hovedfunnene støtter dermed vår hypotese om at benmargslesjoner kan være en overdreven respons for å reparere skadet benvev.

BONE MARROW LESIONS ARE CHARACTERIZED BY INCREASED BONE TURNOVER AND INCREASED VASCULARITYBone Marrow Lesions, previously denoted Bone Marrow Edema are detected as water signals on MR scans. Previous histologic studies were unable to demonstrate any edematous changes at the tissue level, which led us to hypothesize that the water signal stems from increased vascularization accompanying a high turnover state in bone.To test this hypothesis we performed tetracycline labeling and MR scans of patients planned for total hip replacement surgery. Among 14 femoral heads analyzed so far, 8 revealed BMLs on MR, while 6 were negative. The latter acted as controls in the analysis. On the femoral heads we took out cylindrical biopsies guided by the MR scans. These biopsies were stored in 70% alcohol prior embedding in methyl methacrylate. Subsequently 7 µm thick sections were prepared and subjected to histomorphometric analysis of the cancellous bone using a histomorphometry software. We chose to focus on mineralizing surface as a fraction of total bone surface (MS/BS) and vascular area (sinusoids + blood vessels), but also evaluated mineral apposition rate (MAR), bone formation rate (BFR/BS), bone volume (BV/TV) and trabecular thickness (Tb.Th). The analysis revealed that compared to controls bone tissue from patients with BMLs exhibited increased bone turnover: MS/BS (median (95% Confidence interval)) 8.1% (3.41 – 33.29) vs 0.3% (0.06 – 1.64) (p< 0.0007) and increased vascular area 0.29 mm2(0.17 – 1.14) vs 0.03 mm2 (0.004 – 0.16) (p< 0.03). None of the other variables of interest were different between the two groups. In conclusion, this study confirms that Bone Marrow Lesions are characterized by increased bone turnover and increased vascularity in keeping with it being a reparatory process. Thus, the water signal, which is the hallmark of BMLs on MR, is most probably reflecting increased tissue vascularity, which leads to edema in the bone marrow, and also increased remodeling activity in the bone.

Benomsetnings Betydning for Benmargslesjon og KreftspredningI korte trekk går prosjektet ut på å karakterisere benremodelering og uttrykk av lokale vekst- og inflamassjonsfaktorer i benmetastaser og en bestemt form for forandring i benmarg som sees ved en rekke muskuloskeletale tilstander deriblant leddgikt og slitasjegikt.Utgangspunktet for hele prosjektet er den essensielle betydningen av benomsetningsenheten (BRC) ved to ofte forekomne tilstander i Norge: 1) Benmargslesjoner (BML) som igjen er assosiert med tilstander som osteoporose, reumatoid artritt, senebetennelse og akutte benbrud. 2) Benmetastaser som er forbundet med smerte, benbrudd og dødelighet ved alvorlige krefttilfeller. Målet med studien er tredelt: 1) En videre karakterisering av BRC-dannelse og dets funksjon ved normal benfornyelse. 2) Bestemme betydningen av BRC for utvikling av BML. 3) Undersøke funksjonen til BRC ved utvikling og spredning av benmetastaser. Vi har utviklet en metode, som tillater studium av bensnitt ved hjelp av lys- og fluorescensmikroskopi. Videre vil vi karakterisere involveringen av BRC, en spesifik struktur som er viktig for remodelering av ben på cellenivå. Denne strukturen forener kardannelse og benremodelering, og vår hypotese er at spredning av kreft til ben kun kan skje der hvor BRC ligger på benoverflaten. Vi forventer at våre analyser kan klarlegge betydningen av kardannende vekstfaktorer i benmetastaser og benmargslesjon ved å se på proteinuttrykk i vevet. Prosjektet er foreløpig fortsatt i datainnhentingsfasen, og jobber aktivt for å skaffe nødvendig benmateriale som skulle studeres. Dessverre har vevsanskaffelsen blitt forsinket på grunn av en rekke forhold som er utenfor vår kontroll, for eksempel omorganisering av Oslo universitetssykehus, og sterkt redusert operasjonsaktivitet hos vår viktigste samarbeidspartner. Vi derfor har jobbet for og fått etablert kontakt med flere prosjektmedarbeidere i ortopediske og nevrokirorgiske avdelinger i nye sykehus nettopp for å kunne hente inn nødvendig studiematerialet. Dette ser lovende ut, men vi blir likevel nødt til å ta sikte på en forlengelse av prosjektets forløp etter den opprinnelige rammen på 3 år.

Histological Characterization of The Bone Remodeling CompartmentThe origin for the project was definition of a specialized structure in bone, the Bone Remodeling Compartment (BRC). The next clear goal was therefore to try to find out more about the functions and regulation of this structure and its potential involvement in pathologic conditions.The inner lining of the BRC is the denuded bone surface, while outer lining of this structure is a dome of flattened cells, which display immunoreactivity similar to bone lining cells. This structure has been associated with the regulation of bone remodeling (continuous renewal) activity and metastatic spread of cancer cells to bone. The underlying hypothesis for the whole program is that the BRC plays a pivotal role in the pathogenesis underlying 2 frequent conditions affecting tens of thousands of patients in Norway each year: 1) Bone Marrow Lesions (BMLs), which are associated with pain and progression of inflammatory and non-inflammatory conditions involving bone (osteoarthritis, rheumatoid arthritis, tendinitis, acute fracture). 2) Bone metastases, which cause pain, pathological fractures and mortality in terminal cancer. The aim of the study is threefold: 1) To further characterize local regulation of BRC formation and development during normal bone remodeling. 2) To characterize the involvement of the BRC and protein expression in the microenvironment of BMLs. 3) To characterize the involvement of the BRC and cytokines/growth factors associated with the BRC in the seeding and spread of bone metastases. We plan to do this by employing standard histomorphometric and quantitative immunocytochemical techniques on bone biopsies and surgical waste from operations and on patients with BMLs and bone metastases. Using these techniques we want to ascertain the main cell types, most important cytokines and growth factors (by quantitative immunocytochemistry as well as the bone remodeling activity by quantitative histomorphometry. So far we have been working to a large extent on the methodology. Since the protocols and the laboratory techniques to be applied in this project were developed in Denmark, we had to start by preparing for application of the same methods here in the laboratory for the Department of Biomaterials, Institute of Clinical Dentistry, University of Oslo. We have used time and resources on both equipment and acquirement of necessary expertise and knowhow. We have also had meetings with our collaborators, i.e. physicians, surgeons and orthopedians in Ullevål University Hospital and Diakonhjemmet Hospital, who are going to help us obtain our study samples. As a result we have been able to successfully implement these methods on some human bone samples and been able to verify the correct reproduction of the original protocols. The next step would be to obtain the required number of human bone biopsies from healthy donors and patients in order to be able to start collection of the awaited raw data. The work has been done mainly by the undersigned, a PhD student whose salary is also being paid by the funds granted by Helse Sør-Øst.