Radiation biology and DNA damage signaling

Fosforylering av proteiner utført av såkalte kinaser er svært viktig i DNA-skade-signalering. Flere av de mest kjente og sentrale proteinene i disse signalveiene er kinaser, som for eksempel sjekkpunkt-kinasene Atr, Atm, Chk1 og Chk2. Fosforylering er imidlertid ikke kun regulert av kinaser. En annen klasse proteiner, fosfataser, motvirker kinasene ved å fjerne fosfatgruppene. Det finnes imidlertid lite kunnskap om rollen til fosfataser i DNA-skade-signalveiene. I dette prosjektet har vi oppdaget en tidligere ukjent mekanisme hvordan fosfatasen ”Protein phospatase 1” (PP1) bidrar til å regulere DNA-skade-signalveiene. Vi har funnet at PP1 sammen med bindingspartneren Pnuts (PP1 nuclear targeting subunut) spesifikt hemmer aktiviteten til Atr, men ikke Atm, kinasen. Pnuts/PP1 hemmer Atr både i ubehandlede og bestrålte kreftceller, og i celler utsatt for replikasjonsstress. Overraskende skjer denne reguleringen av Atr-aktivitet uavhengig av tidligere kjente faktorer i Atr regulering, som TopBp1 og Rpa. I samarbeid med kanadiske forskere har vi dessuten utført en massespektometri-basert screen for å identifisere hvilke andre proteiner som binder til Pnuts, og vi fant blant annet bindingspartnerne Wdr82 og Tox4. Nedregulering av Wdr82 og Tox4 ved siRNA transfeksjon viser lignenede effekter på DNA-skade signalveier som nedregulering av Pnuts. Dette tyder på at Wdr82 og Tox4 virker sammen med Pnuts/PP1 i et proteinkompleks som hemmer Atr-aktivitet. Siden Atr er en av de aller mest sentrale kinasene i DNA-skade-signalveiene, er våre resultater svært spennende og representerer verdifull ny kunnskap. Et manuskript er innsendt for å publisere disse resultatene (Landsverk et.al, innsendt 2014 ).

For å utforske potensielle kliniske anvendelser, har vi undersøkt hvorvidt hemming av DNA-skade signaleveier kan brukes til å drepe kreftceller. Vi har vist at hemmere av Polo-like kinase 1 (Plk1) kan føre til økt sråle-følsomhet eller økt stråle-resistens for kreftceller, avhengig av om Plk1-hemmere tilsettes før eller etter bestrålingen. Hvis Plk1-hemmere tilsettes før bestråling, vil cellene akkumulere i M-fase, hvor cellene er ekstra strålefølsomme. Hvis Plk1-hemmere derimot tilsettes etter bestråling, forlenges G2-sjekkpunktet, og cellene får mer tid til å reparere stråleskaden og blir derfor mer resistente. En artikkel som publiserer disse resultatene er akseptert (Lund-Andersen et. al, In press 2014). Vi har også undersøkt effekter av å hemme Checkpoint kinase 1 (Chk1) i hypoksiske kreftceller. Vi har observert at celler er ekstra følsomme overfor Chk1-hemmere i perioden etter at cellene er blitt utsatt for hypoksi. Den økte følsomheten overfor Chk1-hemmere korrelerer med økt DNA-skade i S-fase celler (G.Hasvold et.al 2013).

Innsendte og aksepterte manuskripter:

C. Lund-Andersen, S. Patzke, V. Nähse-Kumpf, R.G. Syljuåsen. Plk1-inhibition can cause radiosensitization or radioresistance dependent on the treatment schedule. In Press, Radiation Therapy and Oncology, 2014.

H.B. Landsverk, L. Ellefsen Sandquist, D. Chamousset, O.J.B. Landsverk, L.Trinkle-Mulcahy, R.G. Syljuåsen. The PNUTS/TOX4/WDR82- PP1 phosphatase complex keeps ATR in check. Submitted, January 2014.

Ioniserende stråling benyttes i stråleterapibehandling av kreft. En bedre forståelse av DNA-skade-signalveiene kan være avgjørende for å finne nye måter å øke strålefølsomheten til resistente kreftceller. Hemmere av Plk1 og Chk1 er for tiden under klinisk og pre-klinisk evaluering. Resultatene fra våre studier av Plk1- og Chk1-hemmere i kombinasjon med stråling eller hypoksi kan potensielt bidra til mer optimal utnyttelse av slike hemmere.

I 2012 ble hoveddelen av midlene fra dette prosjektet brukt til lønn til postdoktor Helga Bjarnason Landsverk (12 måneder) og lønn til stipendiat Christin Lund-Andersen (4 måneder), i tillegg til driftsmidler.

I løpet av 2012 har vi jobbet videre for å forstå hvordan proteinet PNUTS (Phosphatase1 nuclear targeting subunit ) er involvert i de molekylære mekanismene som regulerer DNA reparasjon og cellesyklusprogresjon etter bestråling. Vi oppdaget i et tidligere studie at PNUTS er viktig for DNA-skade responser (H.B. Landsverk et.al EMBO Reports 2010), men de involverte molekylære mekanismene er ikke kjent. I samarbeid med kanadiske forskere har vi utført en massespektometri-basert screen for å identifisere hvilke andre proteiner som binder til PNUTS, og vi fant blant annet bindingspartnerne WDR82 og TOX4. Nedregulering av WDR82 og TOX4 ved siRNA transfeksjon viser lignenede effekter på DNA-skade responser som nedregulering av PNUTS. Dette tyder på at WDR82 og TOX4 virker sammen med PNUTS/PP1 i et proteinkompleks som regulerer DNA-skade-signalering. Masterstudent Lise Ellefsen Sandquist har også bidratt til disse resultatene. Resultatene av dette prosjektet representerer ny verdifull kunnskap om de molekylære mekanismene som styrer DNA-skade reparasjonsprosseser. Vi planlegger å ferdigstille et manuskript til innsendelse i løpet av første halvdel av 2013.

For å utforske potensielle kliniske anvendelser, undersøker vi hvorvidt hemming av DNA-skade-signalering kan brukes til å drepe kreftceller. Stipendiat Christin Lund-Andersen har undersøkt effekter av å hemme Polo-Like-Kinase 1 kombinert med stråleterapi. Hun har oppdaget at PLK1-hemmere kan føre til økt sråle-følsomhet eller økt stråle-resistens for kreftceller, avhengig av om PLK1-hemmere tilsettes 24 timer før, eller like etter bestrålingstidpunktet. Et manuskript som presenterer disse resultatene er innsendt. Som nevnt i årsrapporten i 2011, har også deler av denne bevilgningen blitt brukt til å dekke driftskostnader i forbindelse med våre studier av CHK1-hemmere (se nedenfor: Hasvold et.al, manuscript submitted).

Innsendte manuskripter støttet av dette prosjektet:

C. Lund-Andersen and R.G. Syljuåsen. Dependent on the treatment schedule, PLK1-inhibition combined with radiation can lead to either increased death, or increased survival, of cancer cells. Submitted manuscript.

G.Hasvold, V.Nähse-Kumpf, K. Tkacz-Stachowska, E.K.Rofstad, R.G. Syljuåsen. The efficacy of CHK1-inhibitors is not altered by hypoxia, but is enhanced after reoxygenation. Submitted manuscript (Revised version submitted Jan 31st 2013).

I 2011 ble hoveddelen av midlene fra dette prosjektet brukt til lønn til postdoktor Helga Bjarnason Landsverk. I løpet av det første året har hun jobbet mye med å forstå hvordan proteinet PNUTS (Phosphatase1 nuclear targeting subunit ) er involvert i de molekylære mekanismene som regulerer DNA reparasjon og arrest i G2 cellesyklus fase etter bestråling. Vi oppdaget i et tidligere studie at PNUTS er viktig for DNA-skade responser (H.B. Landsverk et.al EMBO Reports 2010), men de involverte molekylære mekanismene er ikke kjent. I samarbeid med kanadiske forskere utfører vi nå en massespektometri-basert screen for å identifisere hvilke andre proteiner som binder til PNUTS i ubestrålte og bestrålte celler. Vi benytter deretter bl.a. siRNA transfeksjon og protein overutrykk for å forstå hvordan PNUTS og de ulike bindingspartnerne er involvert i DNA-skade signalering. Det forventes at resultatene av dette prosjektet vil gi ny verdifull kunnskap om de molekylære mekanismene som styrer DNA-skade reparasjonsprosseser.

For å utforske potensielle kliniske anvendelser, undersøker vi hvorvidt hemming av DNA-skade signalering kan brukes til å drepe kreftceller. Spesielt undersøkes effekter av å hemme Checkpoint kinase 1 (Chk1) i hypoksiske kreftceller. Vi har observert at celler er ekstra følsomme overfor Chk1-hemmere i perioden etter at cellene er blitt utsatt for hypoksi. Den økte følsomheten overfor Chk1-hemmere korrelerer med økt DNA-skade i S-fase celler. Et manuskript som presenterer disse resultatene er for tiden under utarbeidelse.