Role of splice variation and non-coding RNA expression in the context of TP53 mutational status for Breast Cancer progression

Nesten alle celler i kroppen inneholder det samme genetiske materialet, men hvilke gener som er skrudd av eller på, og hvor aktive de er varierer mellom ulike celletyper og biologiske utviklingsstadier. RNA-sekvensering er en relativt ny metode der hele ”transkriptomet” dvs alle aktive gener, blir lest av, uavhengig om sekvensene er kjent på forhånd eller ikke. I et samarbeid med forskningsgrupper på Rutgers University og Mount Sinai School of Medisin har vi utført RNA-sekvensering på 53 tumor prøver fra brystkreft pasienter. Målet med studien var å identifisere alternative genprodukter og lncRNA (ikke-kodende RNA) transkripter som kan brukes som biomarkører, og eventuelt som direkte mål for terapi. I tillegg til RNAseq har vi utført sekvensering av mitokondrielt DNA fra 5 tumorer med tilhørende normalprøver fra brystkreft pasienter. I en analyse av spleisevarianter og alternative transkripter identifiserte vi spesifikke varianter som var ulikt uttrykt i ulike subgrupper av brystkreft; ER+, ER- og HER2+, i forhold til vevs-prøver fra normalt bryst. Data fra pasienter fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) diagnostisert med Invasive Ductal Carcinoma ble inkludert i studien. I tillegg ble de 53 prøvene fra Radiumhospitalet/Rutgers Univ. brukt som valideringssett for sammenligning mellom ER+ og ER- prøver. Analysen viste utberedt alternativ exon bruk, hvor de fleste begivenhetene var begrenset til en bestemt subtype. Spesifikke isoformer fra genene TPD52, IQCG, MYO6, EPB41L1 og ACOX2 ble bekreftet med qRT-PCR i separate prøver. Uttrykk av to isoformer fra samme genlokus i EPB41L1 og MYO6 var assosierte med ulike kliniske parametere. Vi bekreftet assosiasjonen til ER status og kunne i tillegg se at bestemte isoformer hadde høyere uttrykk i TP53 muterte tumorer, mens andre viste høyere uttrykk i tumorer med villtype TP53. En variant av genet ACOX2 med start i intron 9 (ACOX2-i9) ble valgt ut for funksjonelle studier. ACOX2-i9 viste høyere uttrykk i tumorvev når det ble sammenlignet med normalt brystvev fra den samme pasienten. Dessuten var ACOX2-i9 ekspresjon høyere i ER+/HER2- tumorer i forhold til ER-/HER2-. Videre studier av denne varianten viste at den ble translatert til et 25kDa stort protein som kunne detekteres i brystkreft cellelinjer. Knockdown av denne ACOX2 isoformen ved hjelp av shRNA førte til lavere proliferasjon i både T47D og MDA-MB 436 celler. I tillegg fant vi at uttrykk av ACOX2-i9 var assosiert med god prognose i brystkreft pasienter. lncRNA er transkripter over 200 base par, som ikke translateres til et protein. De senere årene har flere slike transkripter vist seg å spille viktige roller i ulike biologiske prosesser, inkludert tumor progresjon. Vi benyttet oss av RNA sekvenseringsdata fra 35 prøver fra TCGA, i tillegg til data fra 40 prøver fra Radiumhospitalet/Rutgers for å identifisere lncRNA transkripter utrykt i brystkreft prøver. Ab initio transkript sammensetning, der transkripter fra sekvenseringsdata blir modellert uten å bruke en referanse database, ble utført for best mulig å identifisere tidligere ukjente transkripter. Vi identifiserte både kjente lncRNA molekyler, som GAS5 og H19, i tillegg identifiserte vi flere ukjente transkripter som var differensielt uttrykt i ER+/HER2- versus ER-/HER2- pasienter. I tillegg til RNA sekvensering utførte vi sekvensering av det mitokondrielle genomet fra 5 tumor og tilhørende normalprøver fra brystkreftpasienter. Mitokondriene spiller viktige roller i prosesser som metabolisme, autofagi og apoptose. Hver celle inneholder mange mitokondrier, og hvert mitokondrium har flere kopier av sirkulært mitokondrielt DNA (mtDNA). Ved hjelp av long-range amplifisering spesifikt av mtDNA, med påfølgende sekvensering, kunne vi detektere mutasjonsvarianter som var spesifikke for tumoren. I tillegg så vi at flere varianter som var tilstede i normalprøven ikke var detekterbare i tumor vevet. Disse preliminære data peker på en seleksjon av mtDNA varianter i tumorprogresjon. I dette prosjektet ble det utført RNA og DNA sekvensering av brystkreftprøver, og påfølgende analyse av spleisevarianter, long non-coding RNA transkripter (lncRNA) og mitokondrielt DNA. RNA sekvensering er en nyere metodene for å analysere genuttrykk i stor skala. Analysene identifiserte tidligere ukjente gen-produkter, og vi har vist at mange av disse nye transkript-variantene er uttrykt i spesifikke subtyper av brystkreft. Både spleisevarianter og lncRNA transkripter kan dermed være potensielt nye biomarkører. Vi identifiserte en variant av ACOX2 genet, et transkript som startet i intron 9. Dette alternative genproduktet viste høyere uttrykk i tumor prøver, sammenlignet med normalprøver fra samme pasient. I tillegg var denne varianten uttrykt i høyere grad i ER+ prøver sammenlignet med ER- prøver. Funksjonelle studier viste at transkriptet ble translatert til et 25 kDa stort protein som kunne detekteres i mange ulike brystkreft cellelinjer. Videre kunne vi vise at uttrykket av denne isoformen var regulert av ESR1 (østrogenreseptor-a), og at cellevekst og proliferasjon ble hemmet ved «knockdown» av varianten i cellelinjer. ACOX2-i9 varianten var assosiert med god prognose hos brystkreft pasienter. Dette alternative genproduktet, er en potensiell biomarkør for overlevelse, da uttrykk av transkriptet er assosiert med god prognose. I tillegg er denne varianten et mulig mål for terapi. ACOX2 er et enzym involvert i nedbryting av lange ikkeforgrenede fettsyrer, og i biosyntese av gallesyrer. Videre studier vil kunne vise om det er mulig å lage en inhibitor (small molecule inhibotor) som kan rette seg spesifikt mot denne isoformen. Det er uvisst om en slik inhibitor vil ha den ønskede effekt i å hindre cellevekst, men viser likevel at spleisevarianter kan være spesifikke mål for terapi. Vi sekvenserte mitokondrielt DNA (mtDNA) fra tumor prøver og tilhørende normalprøver for å undersøke muligheten for å detektere helt nye biomarkører. Hver celle inneholder mange mitokondrier, og hvert mitokondrium har mange kopier av det 17kB store sirkulære mitokondrie genomet. Somatiske mutasjoner i mtDNA har tidligere blitt observert i flere ulike krefttyper. Et fenomen der mtDNA med ulike haplotyper er tilstede i samme celle, eller i den samme biologiske prøven, kalles heteroplasmi. Kombinasjonen av ulike varianter i mtDNA kan brukes som et "fingeravtrykk" for å identifisere mtDNA spesifikt fra tumoren. Vi observerte at tumorprøven inneholdt nye varianter som ikke var tilstede i normalprøven, og at noen varianter i normalprøven ikke lenger kunne detekteres i mtDNA fra tumoren. De nye variantene i tumoren kan potensielt være mål for terapi dersom de oppstår i gener som koder for proteiner. I tillegg kan "fingeravtrykket" benyttes for å undersøke om pasienter responderer på terapi. mtDNA fra tumorceller kan detekteres i blod, og videre studier av mtDNA i blodprøver vil kunne vise om målrettet sekvensering av mtDNA fra slike prøver vil kunne benyttes i pasientoppfølging for å evaluere responsen på behandlingen.