Mechanisms that maintain genome stability

Mechanisms that maintain genome stability Før en celle kan dele seg må alt DNA replikeres slik at de to dattercellene får en kopi hver av den genetiske informasjonen. Det er etterhvert blitt klart at kollaps av replikasjonsgafler er en av hovedårsakene til genom instabilitet og en viktig faktor i kreftutvikling og i utvikling av resistens mot antibiotika hos bakterier. I dette prosjektet brukes modellorganismen Escherichia coli for å studere mekanismer som fører til kollaps og reparasjon av replikasjonsgafler. Proteinet Hda er studert. Dette er et protein som binder til E. colis beta clamp protein. Beta clamp er et ringformet protein som er strukturelt homologt med eukaryot PCNA, og som i likhet med PCNA sørger for at den replikative DNA polymerase forblir lenket til DNA og sørger for polymerasens høye grad av prosessivitet. Det er foreslått at Hda regulerer hvilken polymerase som skal være bundet til beta clampen når replikasjonsgaffelen støter på en skade og trenger å ha en reparasjonspolymerase bundet istedenfor den replikative polymerasen. Studier av celler med en dårlig (mutert) beta clamp viser at de ikke tåler en økt dose Hda og at denne sensitiviteten er avhengig av at reparasjonspolymerasene er tilstede i cellen. Målet er å også undersøke rollen av Beta clamp proteinet (som Hda binder til). Dette gjør vi ved hjelp av ulike bakteriestammer hvor vi har kombinert enten normalt fungerende eller mutert Beta clamp (DnaN175) med en temperatursensitiv variant av enzymet topoisomerase IV (TopoIV). (TopoIV sørger for å separere de sammentvunnede dattermolekylene etter DNA replikasjon.) Tidligere studier viser at en økt dose av normalt fungerende Beta clamp kan redde cellene i en situasjon hvor det har oppstått brudd eller replikasjonsstopp i DNA på grunn av manglende aktivitet av TopoIV, mens den muterte Beta clampen klarer ikke å redde disse cellene. Foreløpig ser det ut som Beta clamp er involvert i en sentral reparasjonsmekanisme som sørger for at replikasjonsgaflene klarer å gjenoppta normal aktivitet etter å ha støtt på et problem, og dermed sørge for at genomstabilitet opprettholdes (Flåtten I, Helgesen E, Pedersen IB, Waldminghaus T, Rothe C, Taipale R, Johnsen L, Skarstad K. 2017. Phenotypes of dnaXE145A Mutant Cells Indicate that the Escherichia coli Clamp Loader Has a Role in the Restart of Stalled Replication Forks. J. Bacteriology;199(24), 412-417). Vi har også undersøkt rollen til enzymet TopoIV som sørger for å dekatenere (separere) de sammentvunnede dattermolekylene etter DNA replikasjon. Uten denne funksjonen kan ikke datter-kromosomene segregeres til hver sin halvdel av bakteriecellen før celledeling. I bakterier foregår replikasjon og segregering samtidig. Dette betyr at TopoIV må kontinuerlig fjerne sammentvinningen av datter-kromosomene mens replikasjonen foregår. Nøyaktig hvor TopoIV binder gjennom cellesyklus har vært gjenstand for mye uenighet. Vi har funnet, ved hjelp av fluorescence-merking, at TopoIV binder til den bakerste enden av et kompleks (SeqA-komplekset) som organiserer nyreplikert DNA, mens replisomet binder foran. TopoIV følger dermed etter i enden på replikasjonsmaskineriet og følger samme bevegelsesmønster gjennom cellesyklus (Topoisomerase IV tracks behind the replication fork and the SeqA complex during DNA replication in Escherichia coli. Helgesen E, Sætre F, Skarstad K.Sci Rep. 2021 Jan 12;11(1):474. doi: 10.1038/s41598-020-80043-4.PMID: 33436807). HSØ har godkjent at vi fullfører prosjektet. Vi har i 2022 fått gjort mye arbeid på hvordan beta clamp interagerer med to tidligere ukjente interaksjonspartnere, RecB og RecA. Disse er begge viktige faktorer i reparasjon av DNA dobbelttrådbrudd. Resultatene tyder på at beta clamp ikke bare har en rolle i DNA replikasjon men også ved DNA reparasjon andre steder på kromosomet enn ved replikasjonsgaflene. Manuskript vil bli utarbeidet i løpet av 2023. Vår forskningsgruppe driver med utvikling av nye typer antibiotika. Antibiotikaresistens er en global helsetrussel og det er estimert at infeksjoner med antibiotikaresistente bakterier kan drepe så mange som 50 millioner mennesker per år innen 2050. Det er et stort behov for bedre kunnskap om mekanismer som bakterier bruker for å beskytte seg mot antibiotika. Slik kunnskap kan bidra til å finne nye angrepsmål for utvikling av antibiotika som både eradikerer resistente bakterier og også hemmer de mekanismene som bakteriene bruker for å utvikle resistens. Det er kjent at prossesivitetsfaktoren Beta clamp er essensiell for bakterienes overlevelse, da den er sentral i både replikasjon av DNA og reparasjon av DNA. I tillegg er denne faktoren svært viktig for bakterienes plastisitet, dvs evne til å mutere DNA- noe som igjen kan føre til resistens. Beta clamp har mange interaksjonspartnere som spiller viktige roller i disse mekanismene, hvorav mange er fortsatt ukjente. I motsetning så er den eukaryote versjonen, PCNA, godt karakterisert og mer enn 500 partnere har blitt identifisiert. PCNA er derfor et svært populært mål for utvikling av inhibitorer, spesielt innen kreftbehandling. Selv om Beta clamp og PCNA er strukturelt konservert, så er aminosyrehomologien lav. Det vil si at Beta clamp er et svært godt mål for utvikling av inhibitorer som selektivt hemmer Beta clamp og ikke påvirker mekanismer i mammalske celler. Vi har i prosjektet karakterisert nye aspekter ved Beta clamp i forbindelse med reparasjon av DNA og overlevelse, og vi har også identifisert nye partnere (RecA og RecB) som implikerer en enda viktigere rolle for Beta clamp i både DNA reparasjon og plastisitet, nemlig via homolog rekombinering. Dette er en rolle som det tidligere har vært ukjent at blir koordinert via interaksjon med Beta clamp. Gruppen er nå er i ferd med å karakterisere bindingsmotivene mellom Beta clamp og nye partnere, vil vi bruke denne kunnskapen i et innovasjonsprosjekt til å designe peptider som kan hemme bindingene. Dersom dette lykkes vil vi kunne bidra til utvikling av nye antibiotika som slår ned bakterienes evne til å takle eksterne trusler, slik som antibiotika, samtidig som evnen til å utvikle resistens vil bli slått ned. På lengre sikt vil dette kunne bety et sterkt forbedret behandlingstilbud til pasienter som rammes av infeksjoner med antibiotikaresistente bakterier. Så oppsummert, vil resultatene fra dette prosjektet brukes inn mot innovasjon av nye antimikrobielle peptider.