Targeting and regulation of SERCA in the heart

Targeting and regulation of SERCA in the heartEndret lokalisasjon og organisering av proteiner som transporterer calcium i hjertecellene kan forklare svekket kontraksjon ved hjertesvikt.Calcium som utløser hjertets kontraksjon kommer i hovedsak fra en organelle inne i cellene som kalles sarkoplasmatisk retikulum (SR) og slippes ut gjennom en calcium frisettingskanal (ryanodin reseptoren, RyR). Etter hvert hjerteslag må calcium igjen pumpes tilbake i SR. Dette gjøres av en calcium pumpe (SERCA). Endret lokalisasjon og organisering av disse to proteinene vil ha alvorlige konsekvenser for hjertets kontraksjon og relaksasjon f.eks. hos hjertesviktpasienter. I prosjektet har vi hovedsak brukt fire teknikker. 1. Vi har målt "sparks" som er spontan frisetting fra SR av små "pakker" med calcium. Disse frisettingene er elementære hendelser som danner basisen for den globale frisettingen av calcium i forkant av hvert hjerteslag. 2. Lokalisering av SERCA-proteiner er gjort med elektronmikroskopi (EM) av gullmerkede proteiner. 3. Karakterisering av SR membranen som SERCA sitter på er gjort med EM tomografi på tykke snitt og ved hjelp av AiryScan super-resolusjonsmikroskopi. 4. Med hjelp av en ny lysmikroskopi-plattform kan vi også vise lokalisering av RyR med svært høy presisjon. RyR danner clustere slik at åpning og lukking av mange kanaler er koordinert. På den måten blir det et begrenset og godt definert calcium utslipp. Vi har tidligere forutsagt at ødeleggelse av RyR clustere kan bidra til forstyrret calcium utslipp. 5. Matematisk modellering for å simulere effekten av endret lokalisasjon og clusterdannelse av de to proteinene. Dataene viser følgende: • Calcium sparks fra svikthjerter er både er svakere, bredere og tregere enn sparks fra normale celler. • Trege calcium sparks er en sannsynlig årsak til tregere calcium-utslipp under eksitasjon-kontraksjons koplingen. • SERCA ikke er jevnt fordelt i hjertecellene. Det er mindre SERCA ved myofibrillenes A-bånd (de kontraktile elementene i hjertecellene som blir aktivert av calcium) og det finnes en betydelig mengde SERCA rundt området hvor calcium-utslipp skjer (nær RyR). Dette har også blitt verifisert ved bruk av korrelativ widefield/dSTORM lysmikroskopi. • SR er heller ikke jevnt fordelt i hjertecellene. SR distribusjonen er lik som SERCA distribusjonen noe som indikerer at SERCA er uniformt fordelt på SR membranen. • Når SERCA ved dyadene er redusert (etter knock out) så er sparks større og mindre skarpt lokalisert. Preliminære data viser at SR membranen har endret geometri både under SERCA knockout og under hjertesvikt. Dette indikerer at SERCA regulerer organisering av SR-membranen som proteinet sitter på. • RyR-clusterne blir ødelagt under hjertesvikt. RyR clustere fra sviktceller inneholder færre RyR og de er mindre solide enn clustere fra normale celler. • Matematisk modellering viser hvordan ødeleggelsen av RyR clustere kan forklare endringen i calcium utslipp og at SERCAs rolle som nabo til RyR må være indirekte. • Calcium lekkasje under diastolen er forhøyet ved hjertesvikt og denne er ikke spark-mediert. • Modelleringen viser at degraderingen av RyR clustere er den strukturelle basisen for denne ikke spark-medierte calcium lekkasjen og for tregere lokalt utslipp av Calcium Konklusjon. Hvordan SERCA bidrar til lokal kontroll er foreløpig uklart, men våre data indikerer at RyR-clusterne blir ødelagt under hjertesvikt. Dette fører igjen til forstyrret calcium utslipp og bidrar sannsynligvis til svekket kontraksjon.

Hvor sitter calcium-pumpen i hjertecellene?Endret lokalisasjon og organisering av proteiner som transporterer calcium i hjertecellene kan forklare svekket kontraksjon ved hjertesvikt.Calcium som utløser hjertets kontraksjon kommer i hovedsak fra en organelle inne i cellene som kalles sarkoplasmatisk retikulum (SR) og slippes ut gjennom en calcium frisettingskanal (ryanodin reseptoren, RyR). Etter hvert hjerteslag må calcium igjen pumpes tilbake i SR. Dette gjøres av en calcium pumpe (SERCA). Endret lokalisasjon og organisering av disse to proteinene vil ha alvorlige konsekvenser for hjertets kontraksjon og relaksasjon f.eks. hos hjertesviktpasienter. I prosjektet har vi hovedsak brukt fire teknikker. 1. Vi har målt "sparks" som er spontan frisetting fra SR av små "pakker" med calcium. De dør ut av seg selv uten å utløse en full kontraksjon av hjertet. Frisetting av calcium i hjertet er nemlig en selvforsterkende prosess - en positiv tilbakekobling - som er viktig for å få en synkron og kraftig kontraksjon av hele hjertet. Det betyr at det er ekstremt viktig å holde calciumomsetningen under kontroll når hjertet skal hvile mellom slagene, ellers vil hjertet ende i en kontraktur (steinhjerte). Denne kontrollen må skje på molekylært og lokalt nivå slik at størrelsen på sparks både i tid og rom er begrenset. 2. Lokalisering av SERCA-proteiner er gjort med elektronmikroskopi av gullmerkede proteiner. 3. Med hjelp av en ny lysmikroskopi-plattform kan vi også å vise lokalisering av RyR med svært høy presisjon. RyR danner clustere slik at åpning og lukking av mange kanaler er koordinert. På den måten blir det et begrenset og godt definert calcium utslipp. Vi har tidligere forutsagt at ødeleggelse av RyR clustere kan bidra til forstyrret calcium utslipp. 4. Matematisk modellering for å simulere effekten av endret lokalisasjon og clusterdannelse av de to proteinene. Dataene viser følgende: • Calcium sparks fra svikthjerter er både er svakere, bredere og tregere enn sparks fra normale celler. • Trege calcium sparks er en sannsynlig årsak til tregere calcium-utslipp under eksitasjon-kontraksjons koplingen. • SERCA ikke er jevnt fordelt i hjertecellene. Det er mindre SERCA ved myofibrillenes A-bånd (de kontraktile elementene i hjertecellene som blir aktivert av calcium) og det finnes en betydelig mengde SERCA rundt området hvor calcium-utslipp skjer (nær RyR). Dette har også blitt verifisert ved bruk av korrelativ widefield/dSTORM lysmikroskopi. • Når SERCA ved dyadene er redusert (etter knock out) så er sparks større og mindre skarpt lokalisert. Det er uklart hvordan SERCA-proteinene kan bidra til dette • RyR-clusterne blir ødelagt under hjertesvikt. RyR clustere fra sviktceller inneholder færre RyR og de er mindre solide enn clustere fra normale celler • Preliminærdata kan tyde på at RyR-clusterne også kan bli ødelagt under SERCA knock out. • Degraderingen kan forklare hvorfor calcium utslipp skjer tregere. • Matematisk modellering viser hvordan ødeleggelsen av RyR clustere kan forklare endringen i calcium utslipp og at SERCAs rolle som nabo til RyR må være indirekte. • Calcium lekkasje under diastolen er forhøyet ved hjertesvikt og denne er ikke spark-mediert. • Modelleringen viser at degraderingen av RyR clustere er den strukturelle basisen for denne ikke spark-medierte calcium lekkasjen og for tregere lokalt utslipp av Calcium Konklusjon. Hvordan SERCA bidrar til lokal kontroll er foreløpig uklart, men våre data indikerer at RyR-clusterne blir ødelagt under hjertesvikt. Dette fører igjen til forstyrret calcium utslipp og bidrar sannsynligvis til svekket kontraksjon.

Hvor sitter calcium-pumpen i hjertecellene?Endret lokalisasjon og organisering av proteiner som transporterer calcium i hjertecellene kan forklare svekket kontraksjon ved hjertesvikt.Calcium som utløser hjertets kontraksjon kommer i hovedsak fra en organelle inne i cellene som kalles sarkoplasmatisk retikulum (SR) og slippes ut gjennom en calcium frisettingskanal (ryanodin reseptoren, RyR). Etter hvert hjerteslag må calcium igjen pumpes tilbake i SR. Dette gjøres av en calcium pumpe (SERCA). Endret lokalisasjon og organisering av disse to proteinene vil ha alvorlige konsekvenser for hjertets kontraksjon og relaksasjon f.eks. hos hjertesviktpasienter. Prosjektet var opprinnelig knyttet til lokalisering av SERCA, men disse to proteinene samspiller så tett at også RyR måtte inkluderes. I prosjektet har vi hovedsak brukt fire teknikker. 1. Vi har målt "sparks" som er spontan frisetting fra SR av små "pakker" med calcium. De dør ut av seg selv uten å utløse en full kontrakson av hjertet. Frisetting av calcium i hjertet er nemlig en selvforsterkende prosess - en positiv tilbakekobling - som er viktig for å få en synkron og kraftig kontraksjon av hele hjertet. Det betyr at det er ekstremt viktig å holde calciumomsetningen under kontroll når hjertet skal hvile mellom slagene, ellers vil hjertet ende i en kontraktur (steinhjerte). Denne kontrollen må skje på molekylært og lokalt nivå slik at størrelsen på sparks både i tid og rom er begrenset. 2. Lokalisering av SERCA-proteiner er gjort med elektronmikroskopi av gullmerkede proteiner. 3. Med hjelp av en ny lysmikroskopi-plattform kan vi også å vise lokalisering av RyR med svært høy presisjon. RyR danner clustere slik at åpning og lukking av mange kanaler er koordinert. På den måten blir det et begrenset og godt definert calcium utslipp. Vi har tidligere forutsagt at ødeleggelse av RyR clustere kan bidra til forstyrret calcium utslipp. 4. Matematisk modellering for å simulere effekten av endret lokalisasjon og clusterdannelse av de to proteinene. Dataene viser følgende: • Calcium-utslipp skjer tregere under hjertesvikt. Calcium sparks fra svikthjerter er både er svakere, bredere og tregere enn sparks fra normale celler. • Trege calcium sparks er en sannsynlig årsak til tregere calcium-utslipp under eksitasjon-kontraksjons koplingen. • SERCA ikke er jevnt fordelt i hjertecellene. Det er mindre SERCA ved myofibrillenes A-bånd (de kontraktile elementene i hjertecellene som blir aktivert av calcium) og det finnes en betydelig mengde SERCA rundt området hvor calcium-utslipp skjer (nær RyR). • Når SERCA ved dyadene er redusert (etter knock out) så er sparks større og mindre skarpt lokalisert. Det er uklart hvordan SERCA-proteinene kan bidra til dette. • RyR-clusterne blir ødelagt under hjertesvikt. RyR clustere fra sviktceller inneholder færre RyR og de er mindre solide enn clustere fra normale celler • Degraderingen kan forklare hvorfor calcium utslipp skjer tregere. • Matematisk modellering viser hvordan ødeleggelsen av RyR clustere kan forklare endringen i calcium utslipp og at SERCAs rolle som nabo til RyR må være indirekte. • Calcium lekasje under diastolen er forhøyet ved hjertesvikt og denne er ikke spark-mediert. • Modelleringen viser at degraderingen av RyR clustere er den strukturelle basisen for denne ikke spark-medierte calcium lekasjen Konklusjon. Presis lokalisering og clusterdannelse av RyR er vesentlig for å ha god lokal kontroll av calcium-konsentrasjonen i hjerteceller. Hvordan SERCA bidrar til lokal kontroll er foreløpig uklart. Ødeleggelse av denne fine strukturen er en viktig årsak til dårligere kontroll med calcium-utslipp i sviktende hjerter.

Hvor sitter calcium-pumpen i hjertecellene?Endret lokalisasjon og organisering av proteiner som transporterer calcium i hjertecellene kan forklare svekket kontraksjon ved hjertesvikt.Calcium som utløser hjertets kontraksjon kommer i hovedsak fra en organelle inne i cellene som kalles sarkoplasmatisk retikulum (SR) og slippes ut gjennom en calcium frisettingskanal (ryanodin reseptoren, RyR). Etter hvert hjerteslag må calcium igjen pumpes tilbake i SR. Dette gjøres av en calcium pumpe (SERCA). Endret lokalisasjon og organisering av disse to proteinene vil ha alvorlige konsekvenser for hjertets kontraksjon og relaksasjon. Det er gode holdepunkter for at dette er en tidlig årsak til sviktende kontraksjon av hjertet hos hjertesviktpasienter. Prosjektet var opprinnelig knyttet først og fremst til lokalisering av SERCA, men det har vist seg at disse to proteinene samspiller så tett at også RyR måtte inkluderes. I prosjektet har vi hovedsak brukt fire teknikker. 1. Vi har målt såkalte "sparks" som er spontan frisetting fra SR av små "pakker" med calcium. De dør som regel ut av seg selv uten å utløse en full kontrakson av hjertet. Det er nemlig slik at frisetting av calcium i hjertet er en selvforsterkende prosess - en positiv tilbakekobling - som er viktig for å få en synkron og kraftig kontraksjon av hele hjertet. Det betyr imidlertid at det er ekstremt viktig å holde calciumomsetningen under kontroll når hjertet skal hvile mellom slagene, ellers vil hjertet ende i en kontraktur (steinhjerte). Denne kontrollen må skje på molekylært og lokalt nivå slik at størrelsen på sparks både i tid og rom er begrenset. 2. Lokalisering av SERCA-proteiner er gjort med elektronmikroskopi av gullmerkede proteiner. 3. Med hjelp av en ny mikroskopi-plattform (Zeiss Elyra) kan vi også å vise lokalisering av RyR med svært høy presisjon (super-resolusjon). RyR danner clustere slik at åpning og lukking av mange kanaler er koordinert. På den måten blir det et begrenset og godt definert calcium utslipp. Vi har tidligere forutsagt at ødeleggelse av RyR clustere kan bidra til forstyrret calcium utslipp ved hjertesvikt. 4. Matematisk modellering for å simulere effekten av endret lokalisasjon og clusterdannelse av de to proteinene. Dataene viser følgende: • calcium-utslipp skjer tregere under hjertesvikt. Calcium sparks fra svikthjerter er både er svakere, bredere og tregere enn sparks fra normale celler. • SERCA ikke er jevnt fordelt i hjertecellene. Det er mindre SERCA ved myofibrillenes A-bånd (de kontraktile elementene i hjertecellene som blir aktivert av calcium) og det finnes en betydelig mengde SERCA rundt området hvor calcium-utslipp skjer (nær RyR). • når SERCA ved dyadene er redusert (etter knock out) så er sparks større og mindre skarpt lokalisert. Det er uklart hvordan SERCA-proteinene kan bidra til dette. • RyR-clusterne blir ødelagt under hjertesvikt. RyR clustere fra sviktceller inneholder færre RyR og de er mindre solide enn clustere fra normale celler • degraderingen kan forklare hvorfor calcium utslipp skjer tregere. • matematisk modellering viser hvordan ødeleggelsen av RyR clustere kan forklare endringen i calcium utslipp og at SERCAs rolle som nabo til RyR må være indirekte. Konklusjon. Presis lokalisering og clusterdannelse av RyR er vesentlig for å ha god lokal kontroll av calcium-konsentrasjonen i hjerteceller. Hvordan SERCA bidrar til lokal kontroll er foreløpig uklart. Ødeleggelse av denne fine strukturen er en viktig årsak til dårligere kontroll med calcium-utslipp i sviktende hjerter.

Hvor sitter calcium-pumpen i hjertecellene?Calcium utløser og styrer hvert hjerteslag. Svekket regulering av calciumomsetningen inne i hjertecellene er en av årsakene til hjertesvikt. Hjertecellene har en calciumpumpe -SERCA - som opprettholder normal calciumbalanse. Vi undersøker om endret mengde og "feil" lokalisering av denne pumpen er årsak til svekkede hjerteslag.Calcium som utløser hjertets kontraksjon kommer i hovedsak fra et intracellulært lager - en organelle - som kalles sarkoplasmatisk retikulum (SR). Etter hvert hjerteslag må calcium igjen pumpes tilbake i SR. Dette gjøres av en calcium pumpe ( SERCA). Nedsatt funksjon eller redusert mengde av dette proteinet kan ha alvorlige konsekvenser for hjertets calciumhåndtering og kontraksjon. Mindre calcium pumpet inn i SR gir mindre calcium for neste kontraksjon slik at denne blir svakere. Det er tilfellet hos pasienter med hjertesvikt. Man kunne også tenke seg at mindre calcium pumpet inn i SR betyr at mer calcium forblir aktivt i stimulering av kontraksjonen og således skaper en kronisk stivhet i hjertet. Det vil da være et problem å få fylt hjertet med tilstrekkelig blod mellom slagene. En forstyrrelse av hjertets «fyllefunksjon» er også noe som er observert i pasienter med hjertesvikt. Tidligere studier av hjertesviktpasienter har vist at SERCA er nedregulert, at calciumnivået i SR er redusert og vi har vist i vår gruppe at ved å eliminere SERCA (i en SERCA knockout-mus) induserer vi redusert SR-calciumnivå. I dette prosjektet vil vi se på om ikke bare produksjonen, men også den intracellulære lokaliseringen av dette proteinet har noe å si for hjertets calciumhåndtering og kontraksjon, under normal og nedsatt hjertefunksjon. Vi har sett på snitt av normale- og SERCA-knockout hjerter i høy-resolusjons elektronmikroskop og ved hjelp av gullmerking målt distribusjonen av SERCA i hjerteceller. Vi har også målt såkalte "sparks" som er spontan frisetting fra SR av små "pakker" med calcium. De dør som regel ut av seg selv uten å utløse en full kontrakson av hjertet. Det er nemlig slik at frisetting av calcium i hjertet er en selvforsterkende prosess - en positiv tilbakekobling - som er viktig for å få en synkron og kraftig kontraksjon av hele hjertet. Det betyr imidlertid at det er ekstremt viktig å holde calciumomsetningen under kontroll når hjertet skal hvile mellom slagene, ellers vil hjertet ende i en kontraktur (steinhjerte). Denne kontrollen må skje på molekylært og lokalt nivå slik at størrelsen på sparks både i tid og rom er begrenset. Prosjektet er i god utvikling og blir presentert på en "platform session" på en stor internasjonal konferanse i Baltimore i februar 2015. De foreløpige dataene tyder på følgende: • At SERCA ikke er jevnt fordelt i hjertecellene. Det er mindre SERCA ved myofibrillenes A-bånd (de kontraktile elementene i hjertecellene som blir aktivert av calcium) og det finnes en betydelig mengde SERCA rundt området hvor calcium-utslipp skjer (dyadene). Dette kan bety at SERCA er posisjonert for å "trimme" utslippet av calcium fra SR og begrenser størrelsen på sparks. • At når SERCA ved dyadene er redusert (etter knock out) så er sparks større og mindre skarpt lokalisert. Det kan bety at SERCA også bidrar til lokal kontroll av calcium-utslippet ved å "trimme bort" unødig calcium. Dette er en rolle for SERCA som ikke tidligere er vist. • At ingen subpopulasjon av SERCA er beskyttet mot degradering Konklusjon Calcium-pumpen SERCA bidrar til lokal kontroll av calcium-konsentrasjonen i hjertecellene fordi en stor andel pumpemolekyler er lokalisert tett ved utslippsstedet fo calcium.

Hvor sitter calcium-pumpen i hjertecellene?Calcium utløser og styrer hvert hjerteslag. Svekket regulering av calciumomsetningen inne i hjertecellene er en av årsakene til hjertesvikt. Hjertecellene har en calciumpumpe -SERCA - som opprettholder normal calciumbalanse. Vi undersøker om endret mengde og "feil" lokalisering av denne pumpen er årsak til svekkede hjerteslag.Calcium som utløser hjertets kontraksjon kommer i hovedsak fra et intracellulært lager - en organelle - som kalles sarkoplasmatisk retikulum (SR). Etter hvert hjerteslag må calcium igjen pumpes tilbake i SR. Dette gjøres av en calcium pumpe ( SERCA). Nedsatt funksjon eller redusert mengde av dette proteinet kan ha alvorlige konsekvenser for hjertets calciumhåndtering og kontraksjon. Mindre calcium pumpet inn i SR gir mindre calcium for neste kontraksjon slik at denne blir svakere. Det er tilfellet hos pasienter med hjertesvikt. Man kunne også tenke seg at mindre calcium pumpet inn i SR betyr at mer calcium forblir aktivt i stimulering av kontraksjonen og således skaper en kronisk stivhet i hjertet slik at det ikke kan fylles tilstrekkelig med blod mellom kontraksjonene. En forstyrrelse av hjertets «fyllefunksjon» er også noe som er observert i pasienter med hjertesvikt. Tidligere studier av hjertesviktpasienter har vist at SERCA er nedregulert, at calciumnivået i SR er redusert og vi har vist i vår gruppe at ved å eliminere SERCA (i en SERCA knockout-mus) induserer vi redusert SR-calciumnivå. I dette prosjektet vil vi se på om ikke bare produksjonen, men også den intracellulære lokaliseringen av dette proteinet har noe å si for hjertets calciumhåndtering og kontraksjon, under normal og nedsatt hjertefunksjon. Et annet spørsmål er om det finnes en subpopulasjon av SERCA-proteiner som er beskyttet mot degradering, igjen under både normal og nedsatt hjertefunksjon. Vi har sett på frysesnitt av normale- og SERCA-knockout hjerter i høy-resolusjons elektronmikroskop og ved hjelp av gullmerking målt distribusjonen av SERCA i hjerteceller. De foreløpige dataene tyder på følgende: • At SERCA ikke er jevnt fordelt i hjertecellene, men at de er mindre konsentrert ved myofibrillenes A-bånd (de kontraktile elementene i hjertecellene som blir aktivert av calcium) og at det finnes en betydelig mengde SERCA rundt sentrene for calcium-utslipp (dyadene). Dette virker kontra-intuitivt da SERCA har som oppgave å fjerne calcium fra A-båndene og ikke fra det initielle calcium-utslippet. • At ingen subpopulasjon av SERCA er beskyttet mot degradering Den neste oppgaven blir å finne ut om SERCA, pga nærheten til dyadene, kan modulere selve calcium-utslippet. Dette gjør vi ved å foreta calcium-målinger i SERCA-knockout-hjerter hvor altså SERCA ikke lenger er tilstede nær dyadene.