Identification of novel mechanisms in regulation of DNA damage checkpoints and repair
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 2013017
- Ansvarlig person
- Randi Gussgard Syljuåsen
- Institusjon
- Oslo universitetssykehus HF
- Prosjektkategori
- Doktorgradsstipend
- Helsekategori
- Cancer
- Forskningsaktivitet
- 1. Underpinning
Rapporter
DNA-skade kan oppstå i humane celler pga interne prosesser som DNA-replikasjon, og ytre faktorer som ioniserende stråling. Celler utsatt for DNA-skade aktiverer molekylære signalveier som hindrer cellene i å dele seg og hjelper til å få reparert skaden. Formålet med dette prosjektet var å utforske hvordan to proteiner kalt Wdr82 og Tox4 regulerer DNA-skade–signalveiene. Vi har vist at Wdr82 og Tox4 er del av et proteinkompleks sammen med fosfatasen Pnuts-PP1, og prosjektet bygger særlig på vår tidligere oppdagelse at Pnuts-PP1 regulerer cellesyklus-sjekkpunkter og DNA reparasjon i bestrålte celler (Landsverk et.al EMBO Rep 2010). Siden Wdr82 og Tox4 binder til Pnuts-PP1, ville vi undersøke om Wdr82 og Tox4 spiller en lignende rolle som Pnuts-PP1 i DNA-skade signalveiene.
I prosjektets første del oppdaget vi at både Wdr82 og Pnuts-PP1 hemmer aktivering av ATR-kinasen, en av de aller mest sentrale kinasene i DNA-skade-signalveiene. Dette var ikke tidligere kjent og er derfor et svært viktig og spennende resultat. I disse experimentene benyttet vi siRNA transfeksjon til å nedregulere Wdr82 eller Pnuts i cellene. Derimot ga nedregulering av Tox4 ikke samme effekter. Vi konkluderte derfor at Wdr82- Pnuts-PP1 kan regulere ATR uavhengig av Tox4, og valgte å fokusere videre på rollen til Wdr82. I vårt videre arbeid utførte vi viktige kontroll-eksperimenter for å utelukke at effektene skyldtes såkalte "off-target"-effekter av siRNA transfeksjonen. Vi viste at flere ulike siRNA oligoer for Wdr82 ga samme effekter. I tillegg laget vi siRNA-resistant Wdr82, som vi uttrykte i cellene ved hjelp av lentiviral transduksjon, og fant at dette kunne reversere effektene av Wdr82 siRNA. Lignenede eksperimenter ble utført med siRNA-resistant Pnuts og ulike oligoer for Pnuts. Dermed har vi fått bekreftet våre nye oppdagelser på en grundig måte.
I prosjektets siste fase har vi særlig undersøkt om Wdr82 og Pnuts-PP1 muligvis regulerer ATR-aktivitet via å regulere cellenes transkripsjonsprosess. Nyere forskning har nemlig vist at både Wdr82 og Pnuts-PP1 spiller en viktig rolle i regulering av transkripsjon, og flere nye studier tyder på at det kan finnes sammenhenger mellom signalveier knyttet til transkripsjon og DNA-skade. Våre nye resultater viser at Pnuts-PP1regulerer ATR-aktivitet delvis via å defosforylere RNA polymerase 2, et enzym som deltar i syntesen av mRNA. Vi har dermed oppdaget en ny sammenheng mellom selve transkripsjonsprosessen og ATR-aktivitet. En artikkel som presenterer disse resultatene ble sendt inn i 2017 og er fortsatt i revisjon (se innsendt manuskript nedenfor). Videre har vi funnet at Wdr82 spiller en særlig viktig rolle i forbindelse med såkalt replikasjons-stress i cellene. Våre nyeste resultater tyder på at Wdr82 er nødvendig i cellene for å forhindre kollisjoner mellom transkripsjonsprosessen og replikasjonsprosessen i cellene, og at slike kollisjoner kan bidra til å aktivere ATR når Wdr82 nedreguleres. En artikkel for å presentere disse resultatene er under utarbeidelse, hvor PhD-stipendiat Lise Ellefsen Sandquist er førsteforfatter. I tillegg planlegges et tredje manuskript basert på disse resultatene, som forventes ferdig mot slutten av året. Bevilgningen ble i hovedsak benyttet til lønn til stipendiat Lise Ellefsen Sandquist. Planlagt innlevering av PhD-avhandlingen er utsatt inntil desember 2018 for å få tid til å gjøre ferdig publikasjonene.
Innsendt manuskript, 2017 (fortsatt under vurdering/i revisjon)
Helga B. Landsverk, Lise E. Sandquist, Gro E. Rødland, Beata Grallert, Laura Trinkle-Mulcahy, Randi G. Syljuåsen. ”Regulation of ATR activity by the RNA polymerase II phosphatase PNUTS-PP1”
Ved stråleterapi og mange typer kjemoterapi drepes kreftcellene ved å påføre dem DNA-skade. Aktivering av ATR-kinasen er en viktig del av cellenes forsvars-mekanisme mot slik skade, og hemmere av ATR-kinasen testes derfor for tiden i flere kliniske studier i kombinasjon med stråleterapi eller kjemoterapi. Våre resultater gir ny kunnskap om de grunnleggende mekanismene som styrer cellenes forsvarsresponser mot DNA-skade, og særlig om hvordan ATR aktiveres. Slik kunnskap kan bidra til å finne nye måter å forbedre kreftbehandling på i framtiden.
DNA-skade kan oppstå i humane celler pga interne prosesser som DNA-replikasjon, og ytre faktorer som ioniserende stråling. Celler utsatt for DNA-skade aktiverer molekylære signalveier som hindrer cellene i å dele seg og hjelper til å få reparert skaden. I dette prosjektet utforskes en nesten helt ukjent DNA-skade-signalvei.Formålet med dette prosjektet er å finne ut av hvordan et protein kalt Wdr82 regulerer DNA-skade–signalveiene. Vi har vist at Wdr82 er del av et proteinkompleks sammen med fosfatasen Pnuts-PP1, og prosjektet bygger særlig på vår tidligere oppdagelse at Pnuts-PP1 regulerer cellesyklus-sjekkpunkter og DNA reparasjon i bestrålte celler (Landsverk et.al EMBO Rep 2010). Siden Wdr82 binder til Pnuts-PP1, ville vi undersøke om Wdr82 spiller en lignende rolle som Pnuts-PP1 i DNA-skade signalveiene.
Vi har funnet at både Wdr82 og Pnuts-PP1 hemmer aktivering av ATR-kinasen, en av de aller mest sentrale kinasene i DNA-skade-signalveiene. Det siste året har vi særlig undersøkt om Wdr82 og Pnuts-PP1 muligvis regulerer ATR-aktivitet via å regulere cellenes transkripsjonsprosess. Nyere forskning har nemlig vist at både Wdr82 og Pnuts-PP1 spiller en viktig rolle i regulering av mRNA transkripsjon, og flere nye studier tyder på at det kan finnes sammenhenger mellom signalveier knyttet til transkripsjon og DNA-skade. Våre nye resultater viser at Pnuts-PP1regulerer ATR-aktivitet via å defosforylere RNA polymerase 2, et enzym som deltar i syntesen av mRNA. Vi har dermed oppdaget en ny sammenheng mellom selve transkripsjonsprosessen og ATR-aktivitet. En artikkel som presenterer disse resultatene er klar til innsendelse (se submitted manuskript nedenfor). I vårt pågående og videre arbeid undersøker vi hvordan Wdr82 påvirker RNA polymerase 2 og andre faktorer i transkripsjonsprosessen, for å forstå i detalj hvordan Wdr82 regulerer ATR-aktiviteten.
Bevilgningen blir i hovedsak benyttet til lønn til stipendiat Lise Ellefsen Sandquist.
Submitted manuskript, februar 2017:
Helga B. Landsverk, Lise E. Sandquist, Gro E. Rødland, Laura Trinkle-Mulcahy, Randi G. Syljuåsen. ”Phosphorylation of RNA polymerase 2-CTD signals to ATR via CDC73 and is counteracted by PNUTS-PP1”
DNA-skade kan oppstå i humane celler pga interne prosesser som DNA-replikasjon, og ytre faktorer som ioniserende stråling. Celler utsatt for DNA-skade aktiverer molekylære signalveier som hindrer cellene i å dele seg og hjelper til å få reparert skaden. I dette prosjektet utforskes en nesten helt ukjent DNA-skade-signalvei.Fosforylering av proteiner utført av såkalte kinaser, for eksempel kinasene ATM, ATR og CHK1, er en svært viktig komponent av de signalveiene som blir aktivert ved DNA-skade. En annen type proteiner, fosfataser, kan motvirke kinasene ved å fjerne fosfatgruppene. Sammenlignet med kinasene, finnes det til nå relativt lite kunnskap om hvordan fosfataser inngår i disse DNA-skade-signalveiene. Dette prosjektet bygger videre på vår tidligere oppdagelse at en bindingspartner av PP1-fosfatase, PNUTS (PP1 nuclear targeting subunut), regulerer cellesyklus-sjekkpunkter og reparasjon i bestrålte celler (Landsverk et.al EMBO Rep 2010). Videre har vi oppdaget at nedregulering av PNUTS ved hjelp av siRNA-transfeksjon fører til en markant økning i ATR-aktivitet (Landsverk et.al, manuskript under utarbeidelse). Siden ATR er en av de aller mest sentrale kinasene i DNA-skade-signalveiene, er dette et veldig spennende og viktig resultat.
Formålet til dette prosjektet er å undersøke hvordan WDR82 og TOX4, to andre bindingspartnere til PNUTS, regulerer DNA-skade-signalveiene sammen med PNUTS og PP1.
Resultatene viser at nedregulering av WDR82 ved hjelp av siRNA transfeksjon også fører til en markant økning i ATR-aktivitet, på samme måte som nedregulering av PNUTS. Når Wdr82 (eller PNUTS) nedreguleres, har vi observert økt fosforylering av flere ATR targets (deriblant Chk1 og Rpa) både i bestrålte celler, celler behandlet med thymidin, og i ubehandlede celler. WDR82-PNUTS-PP1 ser dermed ut til å generelt hemme ATR-aktiviteten, uavhengig av ytre stimuli. Flere ulike siRNA-sekvenser for WDR82 har gitt samme resultat. Siden nedregulering av TOX4 ikke har gitt samme effekter, har vi konkludert med at WDR82-PNUTS-PP1 kan regulere ATR uavhengig av TOX4. For å forstå mer eksakt hvilken rolle WDR82 spiller i denne prosessen, undersøker vi nå bl.a. hvordan WDR82 påvirker andre bindingspartnere i komplekset. Vi har funnet at PP1 binder til PNUTS selv om vi nedregulerer WDR82 med siRNA transfeksjon. Vi er også i gang med å undersøke hvorvidt andre kjente bindingspartnere til WDR82, f.eks methyltransferasen Set1, er med til å regulere ATR-aktiviteten.
Bevilgningen blir i hovedsak benyttet til lønn til stipendiat Lise Ellefsen Sandquist, som hadde svangerskapspermisjon i første halvår av 2015.
DNA-skade kan oppstå i humane celler pga interne prosesser som DNA-replikasjon, og ytre faktorer som ioniserende stråling. Celler utsatt for DNA-skade aktiverer molekylære signalveier som hindrer cellene i å dele seg og hjelper til å få reparert skaden. I dette prosjektet utforskes en nesten helt ukjent DNA-skade-signalvei.Fosforylering av proteiner utført av såkalte kinaser, for eksempel kinasene ATM, ATR og CHK1, er en svært viktig komponent av de signalveiene som blir aktivert ved DNA-skade. En annen type proteiner, fosfataser, kan motvirke kinasene ved å fjerne fosfatgruppene. Sammenlignet med kinasene, finnes det til nå relativt lite kunnskap om hvordan fosfataser inngår i disse DNA-skade-signalveiene. Dette prosjektet bygger videre på vår tidligere oppdagelse at en bindingspartner av PP1-fosfatase, PNUTS (PP1 nuclear targeting subunut), regulerer cellesyklus-sjekkpunkter og reparasjon i bestrålte celler (Landsverk et.al EMBO Rep 2010). Formålet til prosjektet er å undersøke hvordan WDR82 og TOX4, to andre bindingspartnere til PNUTS, regulerer DNA-skade-signalveiene sammen med PNUTS og PP1.
I løpet av 2014 har vi undersøkt nærmere hvordan WDR82 og TOX4 sammen med PNUTS regulerer aktiviteten til ATR-kinasen, en av de aller mest sentrale kinasene i DNA-skade-signalveiene. Våre preliminære resultater viste at nedregulering av enten WDR82, TOX4 eller PNUTS ved hjelp av siRNA-transfeksjon førte til en markant økning i ATR-aktivitet. For å validere og utforske disse resultatene har vi nå benyttet flere ulike siRNA-sekvenser for hvert protein og dessuten benyttet flere forskjellige cellelinjer. De nye resultatene tyder på at TOX4 ikke har en direkte rolle i regulering av ATR-aktivitet, men TOX4 kan i noen tilfeller føre til nedregulering av PNUTS, og dermed indirekte regulere ATR-aktiviteten via PNUTS. WDR82 viser derimot en mer direkte rolle i å undertrykke ATR-aktivitet, og denne rollen undersøkes nå nærmere. Et manuskript var innsendt i 2014, men er senere blitt forbedret med flere nye resultater og skal sendes inn på nytt i løpet av våren 2015.
Bevilgningen blir i hovedsak benyttet til lønn til stipendiat Lise Ellefsen Sandquist, som har hatt svangerskapspermisjon siden midten av juni 2014.
DNA-skade kan oppstå i humane celler pga interne prosesser som DNA-replikasjon, og ytre faktorer som ioniserende stråling. Celler utsatt for DNA-skade aktiverer molekylære signalveier som hindrer cellene i å dele seg og hjelper til å få reparert skaden. I dette prosjektet utforskes en nesten helt ukjent DNA-skade-signalvei.Fosforylering av proteiner utført av såkalte kinaser er svært viktig i DNA-skade-signalveiene. Flere av de mest kjente og sentrale proteinene i disse signalveiene er kinaser, som for eksempel sjekkpunkt-kinasene Atr, Atm, Chk1 og Chk2. Fosforylering er imidlertid ikke kun regulert av kinaser. En annen klasse proteiner, fosfataser, motvirker kinasene ved å fjerne fosfatgruppene. Det finnes til nå lite kunnskap om rollen til fosfataser i DNA-skade-signalering. I dette prosjektet utforskes vår tidligere oppdagelse at en bindingspartner av PP1 fosfatase, Pnuts (PP1 nuclear targeting subunut) er involvert i regulering av DNA-skade-signalering (Landsverk et.al EMBO Rep 2010). Formålet til prosjektet er å undersøke hvordan Wdr82 og Tox4, to andre bindingspartnere til Pnuts, er involvert i å regulere DNA-skade-signalering sammen med Pnuts og PP1. I løpet av 2013 har vi vist at nedregulering av Wdr82 eller Tox4 ved siRNA transfeksjon fører til økt aktivering av Atr kinasen i bestrålte kreftceller, på samme måte som nedregulering av Pnuts. Dette tyder på at Wdr82 og Tox4 virker sammen med Pnuts/PP1 i et proteinkompleks som hemmer Atr-aktivitet. Siden Atr er en av de aller mest sentrale kinasene i DNA-skade-signalering, er våre resultater svært spennende og representerer verdifull ny kunnskap. Et manuskript er innsendt for å publisere disse resultatene (Landsverk, Ellefsen Sandquist et.al, innsendt 2014 ).
Prosjektet startet 1.april 2013, og bevilgningen blir i hovedsak benyttet til lønn til stipendiat Lise Ellefsen Sandquist.
Innsendt manuskript:
H.B. Landsverk, L. Ellefsen Sandquist, D. Chamousset, O.J.B. Landsverk, L.Trinkle-Mulcahy, R.G. Syljuåsen. The PNUTS/TOX4/WDR82- PP1 phosphatase complex keeps ATR in check. Submitted, January 2014.
Deltagere
- Lise Ellefsen Sandquist Doktorgradsstipendiat (annen finansiering)
- Helga Bjarnason Landsverk Medveileder
- Randi G. Syljuåsen Hovedveileder
- Helga Bjarnason Biveileder
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til eRapport