Identification of novel mechanisms in regulation of DNA damage checkpoints and repair

DNA-skade kan oppstå i humane celler pga interne prosesser som DNA-replikasjon, og ytre faktorer som ioniserende stråling. Celler utsatt for DNA-skade aktiverer molekylære signalveier som hindrer cellene i å dele seg og hjelper til å få reparert skaden. Formålet med dette prosjektet var å utforske hvordan to proteiner kalt Wdr82 og Tox4 regulerer DNA-skade–signalveiene. Vi har vist at Wdr82 og Tox4 er del av et proteinkompleks sammen med fosfatasen Pnuts-PP1, og prosjektet bygger særlig på vår tidligere oppdagelse at Pnuts-PP1 regulerer cellesyklus-sjekkpunkter og DNA reparasjon i bestrålte celler (Landsverk et.al EMBO Rep 2010). Siden Wdr82 og Tox4 binder til Pnuts-PP1, ville vi undersøke om Wdr82 og Tox4 spiller en lignende rolle som Pnuts-PP1 i DNA-skade signalveiene. I prosjektets første del oppdaget vi at både Wdr82 og Pnuts-PP1 hemmer aktivering av ATR-kinasen, en av de aller mest sentrale kinasene i DNA-skade-signalveiene. Dette var ikke tidligere kjent og er derfor et svært viktig og spennende resultat. I disse experimentene benyttet vi siRNA transfeksjon til å nedregulere Wdr82 eller Pnuts i cellene. Derimot ga nedregulering av Tox4 ikke samme effekter. Vi konkluderte derfor at Wdr82- Pnuts-PP1 kan regulere ATR uavhengig av Tox4, og valgte å fokusere videre på rollen til Wdr82. I vårt videre arbeid utførte vi viktige kontroll-eksperimenter for å utelukke at effektene skyldtes såkalte "off-target"-effekter av siRNA transfeksjonen. Vi viste at flere ulike siRNA oligoer for Wdr82 ga samme effekter. I tillegg laget vi siRNA-resistant Wdr82, som vi uttrykte i cellene ved hjelp av lentiviral transduksjon, og fant at dette kunne reversere effektene av Wdr82 siRNA. Lignenede eksperimenter ble utført med siRNA-resistant Pnuts og ulike oligoer for Pnuts. Dermed har vi fått bekreftet våre nye oppdagelser på en grundig måte. I prosjektets siste fase har vi særlig undersøkt om Wdr82 og Pnuts-PP1 muligvis regulerer ATR-aktivitet via å regulere cellenes transkripsjonsprosess. Nyere forskning har nemlig vist at både Wdr82 og Pnuts-PP1 spiller en viktig rolle i regulering av transkripsjon, og flere nye studier tyder på at det kan finnes sammenhenger mellom signalveier knyttet til transkripsjon og DNA-skade. Våre nye resultater viser at Pnuts-PP1regulerer ATR-aktivitet delvis via å defosforylere RNA polymerase 2, et enzym som deltar i syntesen av mRNA. Vi har dermed oppdaget en ny sammenheng mellom selve transkripsjonsprosessen og ATR-aktivitet. En artikkel som presenterer disse resultatene ble sendt inn i 2017 og er fortsatt i revisjon (se innsendt manuskript nedenfor). Videre har vi funnet at Wdr82 spiller en særlig viktig rolle i forbindelse med såkalt replikasjons-stress i cellene. Våre nyeste resultater tyder på at Wdr82 er nødvendig i cellene for å forhindre kollisjoner mellom transkripsjonsprosessen og replikasjonsprosessen i cellene, og at slike kollisjoner kan bidra til å aktivere ATR når Wdr82 nedreguleres. En artikkel for å presentere disse resultatene er under utarbeidelse, hvor PhD-stipendiat Lise Ellefsen Sandquist er førsteforfatter. I tillegg planlegges et tredje manuskript basert på disse resultatene, som forventes ferdig mot slutten av året. Bevilgningen ble i hovedsak benyttet til lønn til stipendiat Lise Ellefsen Sandquist. Planlagt innlevering av PhD-avhandlingen er utsatt inntil desember 2018 for å få tid til å gjøre ferdig publikasjonene. Innsendt manuskript, 2017 (fortsatt under vurdering/i revisjon) Helga B. Landsverk, Lise E. Sandquist, Gro E. Rødland, Beata Grallert, Laura Trinkle-Mulcahy, Randi G. Syljuåsen. ”Regulation of ATR activity by the RNA polymerase II phosphatase PNUTS-PP1” Ved stråleterapi og mange typer kjemoterapi drepes kreftcellene ved å påføre dem DNA-skade. Aktivering av ATR-kinasen er en viktig del av cellenes forsvars-mekanisme mot slik skade, og hemmere av ATR-kinasen testes derfor for tiden i flere kliniske studier i kombinasjon med stråleterapi eller kjemoterapi. Våre resultater gir ny kunnskap om de grunnleggende mekanismene som styrer cellenes forsvarsresponser mot DNA-skade, og særlig om hvordan ATR aktiveres. Slik kunnskap kan bidra til å finne nye måter å forbedre kreftbehandling på i framtiden.