Regulation of DNA damage signaling by a novel protein phosphatase 1 complex
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 2014035
- Ansvarlig person
- Helga Bjarnason Landsverk
- Institusjon
- Oslo universitetssykehus HF
- Prosjektkategori
- Forskerstipend
- Helsekategori
- Cancer, Generic Health Relevance
- Forskningsaktivitet
- 1. Underpinning
Rapporter
I cellene kan DNA-skade oppstå naturlig eller gjennom ekstern påvirkning og i verste fall føre til kreft. DNA-skade kan også brukes til å motvirke kreft i kreftbehandling, f.eks gjennom stråleterapi eller noen typer cellegift, ved å påføre kreftcellene så stor DNA-skade at de dør. I dette prosjektet var målet å få ny kunnskap om hvordan cellene reagerer på DNA-skade i håp om at denne kunnskapen skal kunne benyttes til å forhindre kreft og/eller bedre kreftbehandling i fremtiden.
Hvis DNA-skaden er tilstrekkelig stor, kan den føre til celledød. Dette er ønskelig å oppnå f.eks i kreftceller under kreftbehandling. Celledød etter DNA-skade blir derimot motvirket av DNA-skade signalveier i cellene. Disse signalveiene fører til aktivering av DNA-reparasjonsmekanismer og forsinker celledeling, det sistnevnte som gir cellene bedre tid til å reparere DNA før celledelingen skjer. I dette prosjektet har vi studert vi ATR kinase, som spiller en svært sentral rolle i disse DNA-skade signalveiene. Vi har oppdaget en ny måte ATR kinase kan bli aktivert på, nemlig via cellenes transkripsjonsmaskineri. Vi fant dette ved å studere en fosfatase, PNUTS-PP1, som er rettet mot RNA polymerase II, hovedenzymet for transkripsjon av cellenes mRNA. siRNA-mediert nedregulering av PNUTS førte til høy ATR aktivering, og dette korrelerte ikke med kjente markører for aktivering av ATR, f.eks. enkelt-trådig DNA, dobbelt-trådige DNA brudd eller DNA replikasjon. Derimot fant vi at den høye ATR aktiviteten som oppstod etter nedregulering av PNUTS var avhengig av fosforylering av RNA polymerase II og et protein som bandt til dette, nemlig det kjente tumorsuppressor proteinet CDC73. Disse resultatene ble nylig publisert i tidsskiftet Nucleic Acids Research.
I tillegg har vi i dette prosjektet funnet at WDR82, en faktor som binder til PNUTS-PP1 og RNA polymerase II, også regulerer ATR-aktivitet og DNA-skade signalveier/DNA-replikasjon på lignende måte som Pnuts-PP1. Resultatene med WDR82 styrker dermed vår oppdagelse at ATR-aktiviteten kan reguleres via cellenes transkripssjonsmaskineri. Et manuskript som presenterer resultatene med WDR82 er planlagt å ferdigstilles i løpet av våren. I vårt fremtidige arbeid vil vi jobbe videre med å forstå hvordan den høye ATR aktiviteten skjer som følge av RNA polymerase II fosforylering.
Hemmere av ATR kinase blir for tiden testet i pre-kliniske og kliniske studier for kreftbehandling. Vi har oppdaget en ny mekanisme for hvordan ATR kinasen blir aktivert i cellene. Vi håper at denne kunnskapen kan benyttes i fremtiden til å finne nye og mer effektive måter å anvende ATR hemmere på.
NEI
DNA-skade signalveiene gjenkjenner DNA skade eller DNA replikasjonsproblemer, og videreformidler dette slik at cellene kan respondere på riktig måte for å unngå genomisk ustabilitet. Vi har funnet en ny måte cellene kan gjenkjenne og formidle DNA skade eller DNA replikasjonsproblemer ved å benytte seg av RNA transkripsjonsmaskineriet.Fosforylering av proteiner er en viktig måte DNA-skade signalveiene formidler nærvær av DNA skade eller DNA replikasjonsproblemer. Enzymene som fosforylerer proteiner, kinasene, har det derfor vært forsket mye på. Derimot er det blitt forsket mye mindre på enzymene som motvirker kinasene ved å fjerne fosforyleringene, nemlig fosfatasene. Tidligere har vi funnet at en regulatorisk del av en slik fosfatase, PP1 nuclear targeting subunit (PNUTS), spiller en rolle i DNA-skade signalveiene. Vi fant at siRNA-mediert nedregulering av PNUTS førte til forlenget nærvær av DNA skade markører og celledelingsarrest i G2 fase (Landsverk et al. 2010). Tidligere er det blitt vist at PNUTS:PP1 kan defosforylere RNA polymerase II (RNAPII) som er ansvarlig for å produsere cellenes mRNA. I tillegg har det blitt hevdet at RNAPII kan spille en direkte rolle i DNA skade signalveiene ved å gjenkjenne og videreformidle skade til ATR kinase. Vi spurte oss dermed om effekten av PNUTS nedregulering på DNA skade signalveiene kunne skyldes dens rolle i defosforylering av RNAPII. For å se på dette, brukte vi en hemmer for kinasen som fosforylerer RNAPII, CDK7. Oppsiktsvekkende nok fant vi at mens ATR signalering og RNAPII fosforylering ble redusert av CDK7 hemmer i kontroll celler, fortsatte de å være høye i PNUTS nedregulerte celler. Dette tyder sterkt på at PNUTS reduserer ATR signalering ved å defosforylere RNAPII. Videre burde aktivering av ATR gjennom RNAPII tillate at ATR aktivitet også kan skje i G1 fase av cellecyclus, når DNA replikasjon ikke pågår. I overenstemmelse med dette, fant vi at nedregulering av PNUTS også økte ATR signalering i sorterte G1 fase celler. Vi har styrket disse funnene ved å bekrefte renheten av G1 populasjonen etter sortering. Vi viste at de sorterte G1 cellene er cyclin A negative og ikke får økt ATR signalering som følge av thymidin, et medikament som fører til replikasjonsstress. For å bekrefte at den økte ATR signaleringen etter nedregulering av PNUTS ikke bare kan skyldes DNA replikasjonsproblemer, sammenlignet vi ATR signalering og DNA replikasjonstress etter hydroxyurea, kjent for å føre til replikasjonsstress, med ATR signalering og DNA replikasjonstress etter nedregulering av PNUTS. Vi fant høyere ATR signalering i PNUTS nedregulerte celler, selv om de hydroxyurea behandlete cellene hadde mer replikasjonsstress. Vi sammenlignet også ATR signalering etter strålingsindusert DNA skade med ATR signalering etter nedregulering av PNUTS, og så at økt ATR signalering etter nedregulering av PNUTS heller ikke bare kan skyldes økt DNA skade. Sammen har disse kontrolleksperimentene styrket hypotesen om at RNAPII kan ha en direkte rolle i ATR aktivering. I litteraturen forsøkte vi å søke etter faktorer som kunne koble fosforylert RNAPII med ATR. En av disse var CDC73, og vi fant at samtidig nedregulering av CDC73 med PNUTS opphevet den høye ATR aktiviteten som vanligvis ble observert etter nedregulering av PNUTS. Nå har vi også verifisert at effektene av CDC73 nedregulering er spesifikke ved å lage cellelinjer som utrykker siRNA resistent CDC73. Til slutt fant vi at CDC73 binder både ATR og RNAPII i co-immunopresipitasjonseksperimenter og at ATR binder RNAPII.
Disse resultatene er skrevet sammen til et manuskript som for tiden er under review:
‘Regulation of ATR activity by the RNA polymerase II phosphatase PNUTS-PP1’ Helga B. Landsverk, Lise E. Sandquist, Gro Elise Rødland, Beata Grallert, Laura Trinkle-Mulcahy, Randi G. Syljuåsen
Etter DNA skade eller når det oppstår problemer mens DNA replikasjonen pågår, blir det satt igang DNA skade signalveier i cellene som fører til DNA reparasjon, cellesyklus arrest eller celledød. Vi har studert hvordan en viktig kinase i DNA-skade signalveiene blir aktivert, og våre resultater viser at det skjer via cellenes transkripsjonsmaskineri.Fosforylering av proteiner har vist seg å være veldig viktig i DNA skade signalveiene, og det blir utført av såkalte kinaser. En viktig kinase i denne sammenheng er ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related (ATR). Fosfatasene motvirker kinasene ved å ta bort fosforyleringer på proteiner. Tidligere har vi vist at en slik fosfatase, som heter PP1 nuclear targeting subenhet (PNUTS)-PP1, påvirker hvor lenge cellene stopper opp i G2 fase av cellesyklus og hvor fort DNA skade reparasjon skjer etter ioniserende stråling. Ved å bruke siRNA mediert nedregulering av PNUTS har vi funnet at PNUTS spesifikt nedregulerer signalering via ATR-kinasen. Det eneste kjente substratet av PNUTS-PP1 er imidlertid RNA polymerase II (RNAPII). RNAPII er blant annet ansvarlig for transkripsjon av mRNA i cellene og er dermed en essensiel del av cellenes transkripsjonsmaskineri. Vi undret oss derfor om PNUTS ved å defosforylere RNAPII kunne påvirke aktivering via ATR. For å ta fatt på dette brukte vi en hemmer for kinasen som fosforylerer RNAPII, CDK7. Vi fant at CDK7 hemmere sterkt reduserte ATR mediert signalering etter ioniserende skade og etter replikasjonsstress indusert av thymidin. For å finne ut om PNUTS-PP1 reduserer ATR signalering ved å defosforylere RNAPII, tilsatte vi CDK7 hemmer til celler som var siRNA transfektert med PNUTS og kontrol siRNA. Påfallende nok fant vi at mens ATR signalering og RNAPII fosforylering ble redusert i kontroll celler, fortsatte de å være høye i PNUTS nedregulerte celler. Dette tyder sterkt på at PNUTS reduserer ATR signalering ved å defosforylere RNAPII. Videre har vi funnet at nedregulering av PNUTS også øker ATR signalering i G1 fase, noe som tyder på at fosforylert RNAPII mediert ATR aktivering ikke er avhenging av DNA replikasjon. I litteraturen forsøkte vi å søke etter faktorer som kunne koble fosforylert RNAPII med ATR. En av disse var CDC73, og vi fant at samtidig nedregulering av CDC73 med PNUTS opphevet den høye ATR aktiviteten som vanligvis ble observert etter nedregulering av PNUTS. Til slutt fant vi at CDC73 binder både ATR og RNAPII i co-immunopresipitasjonseksperimenter og at ATR binder RNAPII.
Dette arbeidet har blitt skrevet sammen til en manuskript som er klart for sending i Februar 2017:
Helga B. Landsverk, Lise E. Sandquist, Gro E. Rødland, Laura Trinkle-Mulcahy, Randi G. Syljuåsen. ”Phosphorylation of RNA polymerase 2-CTD signals to ATR via CDC73 and is counteracted by PNUTS-PP1”
I cellene blir signalveier aktivert som følge av DNA skade, for eksempel i form av ioniserende stråling. Disse DNA skade signalveiene er viktige både for fremveksten av kreft og for kreftbehandling. Fosforylering av proteiner blir utført av kinaser, som spiller en sentral rolle i DNA skade signalveiene. Fosfataser, som motarbeider kinasene ved å fjerne fosforyleringer, er det derimot lite kunnskap om.Vi har funnet at PP1 nuclear targeting subunit (PNUTS), en subenhet av den kjente fosfatasen protein phosphatase 1 (PP1), spiller en viktig rolle i DNA skade signalveiene. Tidligere har vi vist at nedregulering av PNUTS fører til aktivering av et cellesyklus-sjekkpunkt i G2 og forsinker reparasjon av DNA etter ioniserende stråling (Landsverk et al. 2010). Nå forsøker vi å forstå hvilken del av DNA skade signalveiene som blir påvirket av PNUTS. Vi har oppdaget at nedregulering av PNUTS spesifikt fører til aktivering av ataxia telangiectasia and Rad3-related (ATR) kinasen, men ikke ATM kinasen. Nedregulering av PNUTS fører til økt ATR aktivitet både i bestrålte og ubestrålte celler, og etter behandling med Thymidine (en hemmer av DNA-replikasjon). Dette tyder på at PNUTS har en generell rolle i regulering av ATR kinasen. Ved å bruke en siRNA-resistent PNUTS mutant som ikke binder PP1, har vi funnet at PP1 er viktig for den hemmende effekten av PNUTS på ATR aktivitet. Vi har også funnet at raten av defosforylering av ATR substrater (RPA Ser33 og CHK1 Ser317) ikke blir synlig endret etter nedregulering av PNUTS, noe som tyder på at PNUTS:PP1 ikke defosforylerer disse substratene, men fungerer oppstrøms for ATR. Overraskende har vi derimot også funnet at økt ATR aktivitet etter nedregulering av PNUTS er uavhengig av kjente ATR aktiverende faktorer slik som RPA og TOPBP1. Vårt nåværende arbeid er rettet mot å forstå om PNUTS hemmer ATR direkte eller via en eller flere ukjente faktorer. I samarbeid med en Kanadisk gruppe har vi bekreftet at PNUTS er en del av et relativt ukjent protein fosfatase kompleks, PTW-PP1 komplekset, som består av både PNUTS, TOX4, WDR82 og PP1. Vi har også funnet at nedregulering av WDR82, men ikke TOX4, fører til økt ATR aktivitet. Vi jobber derfor nå også for å forstå hvordan WDR82 bidrar i hemming av ATR. Et manuskript som presenterer deler av disse resultatene er under utarbeidelse og forventes innsendt i 2016.
Bevilgningen blir i hovedsak benyttet til lønn til forsker Helga Bjarnason Landsverk, som hadde svangerskapspermisjon i første halvår av 2015.
I cellene blir signalveier aktivert som følge av DNA skade, for eksempel i form av ioniserende stråling. Disse DNA skade signalveiene er viktige både for fremveksten av kreft og for kreftbehandling. Kinasene spiller en sentral rolle i DNA skade signalveiene. Fosfatasene, som motarbeider kinasene, er det derimot lite kunnskap om.Vi har funnet at PP1 nuclear targeting subunit (PNUTS), en subenhet av den kjente fosfatasen protein phosphatase 1 (PP1), spiller en viktig rolle i DNA skade signalveiene. Tidligere har vi vist at nedregulering av PNUTS fører til aktivering av et cellesyklus-sjekkpunkt i G2 og forsinker reparasjon av DNA etter ioniserende stråling (Landsverk et al. 2010). Nå forsøker vi å forstå hvilken del av DNA skade signalveiene som blir påvirket av PNUTS. I vår nye artikkel, som vil bli levert inn i løpet av våren 2015, presenterer vi resultater som viser at nedregulering av PNUTS spesifikt fører til aktivering av ataxia telangiectasia and Rad3-related (ATR) kinasen, men ikke ATM kinasen. Nedregulering av PNUTS fører til økt aktivitet av ATR i både bestrålte og ubestrålte celler, og etter behandling med Thymidine (en hemmer av DNA-replikasjon). Dette tyder på at PNUTS har en generell rolle i regulering av ATR kinasen. Autofosforylering av ATR og forsforylering av ATR substratene RPA Ser33 og CHK1 ble brukt som mål for ATR aktivitet. Vi har også funnet at den økte ATR aktiviteten etter nedregulering av PNUTS overraskende er uavhengig av kjente ATR aktiverende faktorer slik som RPA og TOPBP1. Videre arbeid vil bli rettet mot å forstå om PNUTS hemmer ATR direkte eller via en eller flere ukjente faktorer.
I samarbeid med en Kanadisk gruppe har vi bekreftet at PNUTS er en del av et relativt ukjent protein fosfatase kompleks, PTW-PP1 komplekset, som består av PNUTS, TOX4, WDR82 og PP1. PP1 er viktig for den hemmende effekten av PNUTS på ATR aktivitet, det har vi vist ved å bruke en siRNA-resistent PNUTS mutant som ikke binder PP1. Da nedregulering av WDR82 fører til økt ATR aktivitet, slik som også nedregulering av PNUTS gjør, tyder det på at hele PTW-PP1 komplekset er viktig for hemming av ATR. Vi jobber nå videre for å forstå hvordan WDR82 bidrar i hemming av ATR.
Vitenskapelige artikler
Landsverk HB, Sandquist LE, Sridhara SC, Rødland GE, Sabino JC, de Almeida SF, Grallert B, Trinkle-Mulcahy L, Syljuåsen RG
Regulation of ATR activity via the RNA polymerase II associated factors CDC73 and PNUTS-PP1.
Nucleic Acids Res 2019 02 28;47(4):1797-1813.
PMID: 30541148
Deltagere
- Gro-Elise Rødland Prosjektdeltaker
- Beata Grallert Prosjektdeltaker
- Ole J. B. Landsverk Prosjektdeltaker
- Laura Trinkle-Mulcahy Prosjektdeltaker
- Helga Bjarnason Landsverk Prosjektleder
- Randi G. Syljuåsen Forskningsgruppeleder
- Lise Ellefsen Sandquist Doktorgradsstipendiat (annen finansiering)
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til eRapport