The role of ERM proteins in the formation of endocytic clathrin coated vesicles and the uptake of Shiga toxin
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 2014036
- Ansvarlig person
- Audun Kvalvaag
- Institusjon
- Oslo universitetssykehus HF
- Prosjektkategori
- Utenlandsstipend
- Helsekategori
- Cancer
- Forskningsaktivitet
- 1. Underpinning
Rapporter
Shiga toksin utnytter cellens endocytosemekanismer for eget opptak
Shiga toksiner (Stx) produseres av visse typer E. coli- og S. dysenteria-bakterier. Disse patogenene tas opp gjennom føden og kan medføre alvorlige komplikasjoner som blodig diaré og nyresvikt. Samtidig har Stx flere egenskaper som gir det et stort kreftmedisinsk potensial. I dette studiet undersøker jeg hvordan toksinet tas opp i menneskeceller.
Toksinet binder til et glykosfingolipid på celleoverflaten kalt Gb3. Etter binding blir Stx tatt opp ved endocytose og deretter transportert gjennom cellen, via tidlige endosomer, golgiapparatet og endoplasmatisk retikulum før det transporteres ut i cytosol. I cytosol virker toksinet ved å ødelegge ribosomenes evne til å transkribere nye proteiner, noe som igjen medfører celledød.
Ved siden av nyrecellene er det få friske menneskeceller som uttrykker Gb3. Derimot uttrykkes høye nivåer Gb3 i svært mange krefttyper. Dette kan utnyttes medisinsk ved at man fester kontrastmiddel til en modifisert del av Stx som ikke er toksisk, men som fortsatt binder Gb3 slik at man kan ta bilder av Gb3-positive svulster. Stx kan også brukes som en bærer av forskjellige typer kreftmedisiner for å gi disse tilgang til Gb3-uttrykkende kreftcellers indre strukturer. For å muliggjøre full utnyttelse av toksinets kreftmedisinske potensial er det essensielt å forstå mekanismene rundt cellulært opptak av Stx. I dette studiet modifiserte vi toksinet med et fluorescerende molekyl slik at vi kunne følge det ved hjelp av fluorescens-mikroskopi og analysere hva som skjer når det binder til celler og deretter endocyteres.
Den best studerte endocytosemekanismen i menneskeceller er clathrinmediert endocytose. Clathrin er et protein som danner kurvlignende strukturer på innsiden av cellenes plasmamembran etter å ha interagert med et protein kalt AP2 og transmembrane reseptorer. Kurven som dannes kalles en clathrin-coated pit, og er med på deformere membranen og å danne en vesikkel som inneholder de transmembrane reseptorene og ligander bundet til dem. Når kurven når en diameter på omkring 100 nm snøres den av ved hjelp av proteinet dynamin, og vesikkelen internaliseres og sorteres intracellulært.
Vi brukte celler genmodifisert med en fluorescerende versjon av AP2 og studerte effekten av Shiga toksinets binding til celler på clathrinmediert endocytose generelt og om opptak av andre typer ligander ble påvirket ved bruk av avansert fluorescensmikroskpi. I tillegg studerte vi hvordan Stx tas opp under dannelsen av clathrin assosierte vesikler med molekylær presisjon, slik at vi kunne følge enkeltmolekyler som bandt til cellen før de ble tatt opp. Metoden gjør det mulig å telle antall toksinmolekyler som inngår i en clathrin-coated pit sammenlignet med andre opptaksmekanismer, samt effekten av toksinet på tiden det tar å danne enkeltpits og hvor mange AP2-molekyler som rekrutteres til pits som inneholder Stx sammenlignet med pits som ikke gjør det.
Det viser seg at Stx initielt stimulerer clathrinmediert endocytose når toksinet kommer i kontakt med celler, men at denne stimuleringen avtar over tid og etter hvert reduseres til en frekvens noe lavere enn hos ubehandlede celler. Videre internaliseres flere toksinmolekyler per clathrin-coated pit enn ved endocytose i fravær av clathrin, men i begge tilfeller internaliseres som regel relativt få molekyler per endocytiske hendelse.
Arbeidet er nå sammenfattet i et manuskript som vil bli publisert i løpet av kort tid.
Som nevnt over besitter Shiga toksinet en del egenskaper som gir det kreftmedisinsk og -diagnostisk potensiale. Men fordi det også er giftig for friske celler er det essensielt å studere detaljene rundt opptak og virkning av toksinet for å kunne bruke det medisinsk. Videre er toksinet velegnet til å bruke som verktøy for å studere opptaksmekanismer og intracellulære transportveier, og forskjellige proteiners rolle slike mekanismer. Funnene presentert i dette arbeidet har få umiddelbare konsekvenser for helsetjenesten, men kan på sikt bidra til utviklingen av Stx som kreftmedisin og/eller kreftdiagnostisering.
Shiga toksiner (Stx) produseres av visse typer E. coli- og S. dysenteria-bakterier. Disse patogenene tas opp gjennom føden og kan medføre alvorlige komplikasjoner som blodig diaré og nyresvikt. Samtidig har Stx flere egenskaper som gir det et stort kreftmedisinsk potensial. I dette studiet undersøker jeg hvordan toksinet tas opp i menneskeceller.Toksinet binder til et glykosfingolipid på celleoverflaten kalt Gb3. Etter binding blir Stx tatt opp ved endocytose og deretter transportert gjennom cellen, via tidlige endosomer, golgiapparatet og endoplasmatisk retikulum før det transporteres ut i cytosol. I cytosol virker toksinet ved å ødelegge ribosomenes evne til å transkribere nye proteiner, noe som igjen medfører celledød.
Ved siden av nyrecellene er det få friske menneskeceller som uttrykker Gb3. Derimot uttrykkes høye nivåer Gb3 i svært mange krefttyper. Dette kan utnyttes medisinsk ved at man fester kontrastmiddel til en modifisert del av Stx som ikke er toksisk, men som fortsatt binder Gb3 slik at man kan ta bilder av Gb3-positive svulster. Stx kan også brukes som en bærer av forskjellige typer kreftmedisiner for å gi disse tilgang til Gb3-uttrykkende kreftcellers indre strukturer. For å muliggjøre full utnyttelse av toksinets kreftmedisinske potensial er det essensielt å forstå mekanismene rundt cellulært opptak av Stx. I dette studiet modifiserte vi toksinet med et fluorescerende molekyl slik at vi kunne følge det ved hjelp av fluorescens-mikroskopi og analysere hva som skjer når det binder til celler og deretter endocyteres.
Den best studerte endocytosemekanismen i menneskeceller er clathrinmediert endocytose. Clathrin er et protein som danner kurvlignende strukturer på innsiden av cellenes plasmamembran etter å ha interagert med et protein kalt AP2 og transmembrane reseptorer. Kurven som dannes kalles en clathrin coated pit, og er med på deformere membranen og å danne en vesikkel som inneholder de transmembrane reseptorene og ligander bundet til dem. Når kurven når en diameter på omkring 100 nm snøres den av ved hjelp av proteinet dynamin, og vesikkelen internaliseres og sorteres intracellulært.
Vi brukte celler genmodifisert med en fluorescerende versjon av AP2 og studerte effekten av Shiga toksinets binding til celler på clathrinmediert endocytose generelt og om opptak av andre typer ligander ble påvirket. I tillegg studerte vi hvordan Stx tas opp under dannelsen av clathrin assosierte vesikler med molekylær presisjon, slik at vi kunne følge enkeltmolekyler som bandt til cellen før de ble tatt opp. Metoden gjør det mulig å telle antall toksinmolekyler som inngår i en clathrin coated pit, samt effekten av toksinet på tiden det tar å danne enkeltpits og hvor mange AP2-molekyler som rekrutteres til pits som inneholder Stx sammenlignet med pits som ikke gjør det.
Arbeidet med å nøste opp i mekanismene rundt cellulært opptak av Stx pågår fortsatt og vil bli publisert etter at ytterligere studier er gjennomført.
Doktorgrader
Audun Sverre Myrset Kvalvaag
Shiga toxin: Uptake and transport in cancer cells
- Disputert:
- oktober 2015
- Hovedveileder:
- Kirsten Sandvig
Deltagere
- Tom Kirchhausen Forskningsgruppeleder
- Kirsten Sandvig Forskningsgruppeleder
- Audun Sverre Myrset Kvalvaag Postdoktorstipendiat
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til eRapport