NLRP3 inflammasome – a sensor, mediator, and regulator of cardiac mitochondrial stress

NLRP3 inflammasome – a sensor, mediator, and regulator of cardiac mitochondrial stressNår celler dør, frigjøres det en rekke molekyler, faresignaler, som vanligvis ikke er tilgjengelige på utsiden av celler. NLRP3 er en intracellulær reseptor som aktiveres indirekte av slike faresignaler og iverksetter betennelse bl.a. ved å aktivere interleukin-1. Det er forøvrig lite kjent hvordan NLRP3 aktiveres og reguleres i hjertets celler.Vi har tidligere vist at fibroblaster, den tallmessige største gruppen celler i hjertet, uttrykker NLRP3 hvis de aktiveres av et faresignal som aktiverer såkalte Toll-lignende reseptorer (TLR) (Signal 1). Hvis cellene deretter eksponeres for faresignalet ATP (signal 2) aktiveres NLRP3 indirekte. Det viktigste funksjonelle endepunktet for NLRP3-aktivering er frigjøring av cytokinet interleukin 1 beta (IL-1) Fra studier på hvite blodceller er det gode holdepunkter for at mitokondriene har en viktig rolle i aktiveringen av NLRP3. Det er ikke kjent hvilke(t) molekyl(er) som direkte binder og aktiverer NLRP3 (liganden). I både hjertet og andre vev vil gamle og defekte mitokondrier i cellene fjernes vha såkalt mitofagi og gi rom for nye friske mitokondrier. Hemming av mitofagi i hvite blodceller øker IL-1-utskillelsen. Kort oppsummert samlet vi i 2014 data som tyder på at NLRP3 i hjertefibroblaster fra mus utrykkes i organellen endoplasmatisk reticulum og assosieres med mitokondrier etter aktivering med signal 2, i en prosess som i hvert fall delvis var avhengig av spesifikt mitokondrielt oksidativt stress. Sulting av celler, som øker mitofagi, reduserte utskillelsen av IL-1 men ikke av andre NLRP3-uavhengige cytokiner, og uten å redusere NLRP3 og IL-1 syntesen. Vi fant ingen sikker link mot mitokondrielt DNA. I 2015 har vi jaktet vi på den hittil ukjente NLRP3-liganden med en hypotese-genererende metode. Som modell brukte vi humane monocytter isolert fra buffy coat (et restprodukt vi kjøper fra blodbanken). Til grunn for dette valget ligger hypotesen om at liganden vil være den samme i alle celletyper, både i mennesker og andre pattedyr. Valget av humane monocytter har mange fordeler: vi både unngår bruk av cellelinjer (som kan være heftet med en rekke artefakter) og ikke minst, slipper vi å avlive dyr. Vi genererte en protokoll der NLRP3 fra humane monocytter isoleres ut fra cellene (immunopresipitering) for så å bli analysert i en massespektrograf som kan vise hvilke andre proteiner som er bundet til NLRP3. Ved å sammenligne NLRP3s bindingpartnere fra NLRP3 isolert fra både ikke-aktiverte og aktiverte celler (signal 1 alene eller signal 1 + 2) kan man komme fram til mulige kandidater. Forsøkene våre viste tallrike kandidater, flere enn vi kan forfølge, hvilket tyder på at aktiveringen av NLRP3 medfører en uspesifikk binding av en rekke proteiner til et proteinaggregat hvor NLRP3 også er med. Neste skritt vil derfor være å utvikle en ny protokoll der proteinene i cellene påføres kovalente kryssbindinger (f.eks. med paraformaldehyd) før de isoleres ut av cellene. Da kan cellene lyseres med en mer stringent lyseringsbuffer slik at uspesifikk binding forekommer i svært liten grad. De kovalente bindingene kan så reverseres vha varme før prøvene analyseres med massespektrografi. I 2015 fullførte vi også en studie hvor vi sammenlignet reperfusjonsskade på mus som mangler NLRP3 med vanlige mus etter akutt hjerteinfarkt. Til vår overraskelse var skadene størst hos mus som mangler NLRP3, og våre mekanistiske data tyder på at NLRP3 kan være involvert i beskyttende signalveier i hjertet. Artikkelen heter "NLRP3 inflammasome activation during myocardial ischemia reperfusion is cardioprotective" og er publisert i 2016. Øystein Sandanger er innvilget permisjon av Helse-Sørøst fra postdoc-stillingen fra 01.11.2015 til 31.10.2016. I dette tidsrommet vil ha jobbe som LIS på hudavdelingen ved Rikshospitalet.

NLRP3-inflammasomet: en sensor, mediator og regulator av mitokondrielt stress i hjertetNår celler dør, frigjøres det en rekke molekyler, faresignaler, som vanligvis ikke er tilgjengelige på utsiden av celler. NLRP3 er en intracellulær reseptor som aktiveres indirekte av slike faresignaler og iverksetter betennelse bl.a. ved å aktivere interleukin-1. Det er forøvrig et lite kjent hvordan NLRP3 aktiveres og reguleres i hjertets celler.Vi har tidligere vist at fibroblaster, den tallmessige største gruppen celler i hjertet, uttrykker NLRP3 hvis de aktiveres av et faresignal som aktiverer såkalte Toll-lignende reseptorer (TLR) (Signal 1). Hvis cellene deretter eksponeres for faresignalet ATP (signal 2) aktiveres NLRP3 indirekte. Det viktigste funksjonelle endepunktet for NLRP3-aktivering er frigjøring av cytokinet interleukin 1 beta (IL-1) Fra studier på hvite blodceller er det gode holdepunkter for at mitokondriene har en viktig rolle i aktiveringen av NLRP3. Det er ikke kjent hvilke(t) molekyl(er) som direkte binder og aktiverer NLRP3 (liganden) selv om flere vidt ulike kandidater er foreslått, inkludert TXNIP, mitokondrielt DNA og cardiolipin, alle molekyler som kan komme fra mitokondriene. I både hjertet og andre vev vil gamle og defekte mitkondrier i cellene fjernes vha såkalt mitofagi og gi rom for nye friske mitokondrier. Hemming av mitofagi i hvite blodceller øker IL-1-utskillensen. I et aldrende hjerte er det flere dysfunksjonelle mitokondrier og mitofagi-aktiviteten er lavere enn i unge hjerter. Dyrestudier tyde på at mitofagi kan være beskyttende mot aldersrelatert hjertesykdom som hjertesvikt . Vi ønsker å karakterisere mer nøyaktig hvordan NLRP3 aktiveres i hjerteceller og bekrefte en eventuell link til mitokondriell dysfunksjon og mitofagi, da dette vil kunne bidra til å bedre forståelsen av medfødt immunitet samt både akutt og kronisk hjertesykdom. Prosjektet startet opp høsten 2014. Våre studier av hjertefibroblaster fra mus med konfokal mikroskopi viser at NLRP3 i hvilende celler utrykkes i organellen endoplasmatisk reticulum, og at noe NLRP3 assosierer med mitokondrier etter aktivering med signal 2, men ingen tydelig assosiasjon med mitokondrielt DNA. Når cellene utsettes for spesifikk hemming av mitkondrienes oksiderende molekyler (mtROS), reduseres utskillelse av IL-1, mens induksjon av generell dannelse av oksidative molekyler (ROS) i cellen ikke øker sekresjonen av IL-1. Sulting av celler, som øker mitofagi, reduserer utskillensen av IL-1 men ikke av andre NLRP3-uavhengige cytokiner, og uten å redusere NLRP3 og IL-1 syntesen (mRNA). Preliminære data tyder også på at kjemiske stoffer som beskytter mitokondriene ved stress, som cyclosporin A og resveratrol, reduserer utskillelsen av IL-1. Samlet tyder dataene på at NLRP3 i hjertefibroblaster assosierer med mitokondrier ved aktivering, og at mtROS men ikke generell ROS er medvirkende til NLRP3 aktivering. Pågående studier av mer spesifikk induksjon av mitofagi, samt repetisjon av forsøk hvor mitkiondriene beskyttes mot stress for å bekrefte mitokondrienes rolle i NLRP3-aktiveringen er neste kortsiktige mål. Så starter forhåpentligvis jakten på liganden. Vi har også injisert vildtype-mus (WT) og mus som mangler NLRP3 (NLRP3 KO) med LPS (signal 1) og sammenlignet hjertefunksjonen deres. Det er velkjent at blodforgiftning medfører en redusert hjertefunksjon. Vi så forøvrig ingen forskjell i hjertefunksjon mellom WT og NLRP3 KO-mus i denne enkle sepsis-modellen. Pga Øystein Sandangers kones arbeidssituasjon gjør den totale familiesituasjonen (gift med 2 barn på hhv 2 og 4 år) at han ikke har mulighet til å gjennomføre utenlandsoppholdet som planlagt.