Intra-patient HPV genetic variation - a new and specific marker for cancer development

Prosjektets hovedmål var definert som en hypotetisk antakelse om at det finnes en sammenheng mellom genetisk endring av HPV og forløp mot kreft; og at enkelte virusvarianter og genetiske mønstre kan assosieres med økt risiko for malign endring. I sin avhandling «Characterisation of human papillomavirus genomic variation and chromosomal integration in cervical samples», har Sonja Lagström lagt et solid teknologisk grunnlag for å finne svar på definerte hypoteser og generert de første funnene som støtter opp om dem. Resultatene viser at det foregår en stor grad av genetisk forandring i HPV og funnene legger et viktig grunnlag for videre kartlegging av årsakssammenheng mellom særskilte forandringer og kreftutvikling. Sammenligning av genetiske mønstre i de to mest onkogene HPV-typene, HPV16 og HPV18, viser forskjeller som kan tyde på ulike underliggende mekanismer og med mulig fremtidig klinisk anvendelse. Resultatene er presentert i følgende tre artikler: 1. Scientific reports, 2019, 9(1), 1-12 Denne artikkelen beskriver utviklingen av en metode basert på DNA-sekvenseringsteknologi for molekylær analyse av HPV-genomet. Metoden, TaME-seq, er unik med tanke på mulighetene den gir for fremtidig forskning og med tanke på kosteffektivitet, sammenliknet med tilsvarende metoder for samme formål. Metoden tar for seg de fem mest onkogene HPV genotypene og dokumenterer særdeles gode egenskaper. Fortrinnet med metoden er simultan deteksjon av genetisk variasjon, delesjon og integrasjon av virusets arvestoff i det humane arvestoffet. Et ytterligere fortrinn er muligheten til å påvise genetisk variasjon med lav relativ forekomst i cellene som studeres, og derved avdekke pågående mutagene prosesser i persistente infeksjoner. 2. Journal of Clinical Virology 2019, 119, 24-30 Det evolusjonært stabile HPV-viruset viser i dette studiet, og samtidige publikasjoner, et uventet høyt nivå av genomisk variasjon når det sekvenseres dypt. Minoritetsvarianter som ble oppdaget her kan kaste nytt lys på genomisk ustabilitet i HPV og den HPV-induserte kreftutviklingen hos vertsceller. Vi vet foreløpig lite om mutagenese hos HPV og enda mindre hvordan dette står i sammenheng med kreftutvikling. Studiet, et samarbeid med kollegaer i Nederland, kom i stand da ingen tidligere har sett på mutagenese i longitudinelle prøver. Våre funn foreslår at det mutasjonelle avtrykket i HPV16 er forskjellig mellom pre-kliniske lesjoner og transformerende infeksjoner. Vi fant i tillegg en rekke lav-frekvensvarianter som et tidligere populasjonsstudie knyttet til høyere risiko for høygradige lesjoner. Disse funnene danner utgangspunkt for videre studier som utforsker kausalitet mellom nye genomiske varianter som oppstår i løpet av en infeksjon og kreftutvikling. 3. MedRxiv: https://doi.org/10.1101/2020.11.25.20238477 Integrasjon av HPV DNA i vertsgenomet betraktes som en kritisk genomisk endring og en avgjørende hendelse i utviklingen av livmorhalskreft. Den nøyaktige mekanismen for integrasjon og betydning for kreftprogresjon er imidlertid ikke fullt ut karakterisert. Nye studier har avdekket genomisk variabilitet forårsaket av forskjellige mutagene prosesser, hvorav den ene er relatert til det humane antivirale proteinet APOBEC3. I mangel på studier som karakteriserer HPV-genomvariasjon og kromosomale integrasjonshendelser som sammenligner forskjellige HPV-typer, ble dette studiet initiert. Totalt sett viser HPV16 positive prøver en høyere grad av variasjon og distinkte APOBEC3-signaturprofiler, mens HPV18 viser høyere integrasjonsfrekvenser og et større antall integrasjonshendelser per prøve. Denne kunnskapen bringer oss et skritt videre i å forstå forskjellige mekanismer i HPV16- og HPV18-indusert kreftutvikling, og vil være av stor interesse for forskersamfunnet og med mulig fremtidig klinisk anvendelse. Prosjektet har publisert en detaljert prosedyre for dypsekvensering av foreløpig fem onkogene HPV genotyper, med demonstrasjon om hva som produseres og i hvilket format. Metoden heter TaME-seq. Metoden kan settes opp i laboratorier hvor som helst i verden og data kan sammenliknes med de vi har produsert og det som kommer fra andre grupper. Metoden åpner for at vi kan lære mer om HPV og kreftutvikling og med større populasjonsstudier vil man kunne undersøke assosiasjoner mer nøyaktig og med høyere signifikansnivå. Vi har siden etableringen av metoden jobbet med Folkehelseinstituttet i Nederland i nettopp slike studier og fått bedre forståelse av hvordan mutasjoner genereres i virusinfeksjoner. Arbeid pågår for å tilpasse metoden til SARS-CoV-2 sekvensering i samarbeid med FIMM i Finland. Analysen er kostnadseffektiv og kan lett oppskaleres til hundrevis av paralleller. Metoden er i dag først og fremst et forskningsverktøy som bidrar til å søke frem biomarkører som på sikt kan benyttes diagnostisk i helsevesenet. Prosjektet har gitt bedre forståelse av følgende potensielle biomarkører: genetisk variasjon av HPV, mutasjonsprofiler og kromosomal integrasjon. Denne kunnskapen kan komme til å få anvendelse i helsevesenet med forventinger om personlig tilpasset medisin. Innovasjon: En patentsøknad (NL2022043) for prosjektets nye metode TaME-seq ble innlevert i 2018 i samarbeid med Inven2. En foreløpig rapport fra det europeiske patentkontoret ble mottatt i mai 2019. Patentsøknaden ble optimalisert med nye data som styrker beskyttelse av metoden og ble innsendt november 2019. Inven2 har hatt kontakt inn mot ulike aktører og industri. Avventer KOL (key opinion leader) rapport fra Inven2 om videre valideringer av metoden. Patentsøknaden går i nasjonal fase i mai og en avklaring om samarbeid og videreføring må gjøres. Gruppen har også fokusert på overføring av protokoller til andre virus som HIV og SARS-CoV-2 og arbeid pågår for å tilpasse metoden til disse. Inven2 har oppmuntret til innsending av ny DOFI for å initiere tilleggsprosjekter med protokolloverføring.