Targeting the glutamine shuttle to regulate synaptic plasticity, ontogeny and pathology

Signalstoff Glutamat og GABA er det mest utbredte henholdsvis stimulerende og hemmende signalstoff i hjernen og retina og som opprettholder mange av våre hjernefunksjoner og synssansen. Glutamin antas å være den viktigste forløperen for begge, men hvordan glutamin tilføres nerveceller har vært ukjent. Oppdagelsen av en familie med glutamintransportører Vi identifiserte en familie av cellemembran-proteiner (såkalte transportører) som transporterer glutamin gjennom cellemembranen (Cell 1999). SN1 og SN2 anrikes på overflaten av Müller- og astrogliaceller og frigjør glutamin, mens SAT1 og SAT2 transporterer glutamin inn i henholdsvis GABAerge og glutamaterge nerveceller. SN1 er spesielt interessant fordi den kan transportere glutamin begge veier samtidig som den har en iboende kanal som tillater ione-flukser. SN1 bidrar derfor ikke bare til signalstoffdannelse, men påvirker også cellemembranpotensialer, aktiverer enzymer og regulerer metabolske prosesser med mer. Vi ønsket derfor å studere hvordan SN1 blir regulert, hvordan slik regulering påvirker signalstoff-resirkulering og synaptisk plastisitet og bidrar til patofysiologi. SN1 dysfunksjon er assosiert med patologi Leversykdom er nest vanligste årsak til tapte arbeidsår i Europa og en hyppig dødsårsak i USA. Leversykdom gjør at ammonia (toksisk endepunkt av proteinkatabolisme) ikke detoksifiseres i leveren, men i stedet akkumuleres i hjernen og retina. Det resulterer i at pasientene blir forvirret, synet svekkes, hjernen sveller og i siste instans kan de dø. Men det har vært uvisst hvordan ammonia fører til encefalopati og retinopati. Vi har nå demonstrert at ammonia binder seg til og nedregulerer SN1 (og SN2) i astrogliaceller og retinale Müller celler og forhindrer at SN1 frigjør glutamin. Dermed hopes glutamin i gliaceller mens synaptisk transmisjon reduseres i nerveceller. Dette resulterer henholdsvis i ødemdannelse og forstyrret nervecellesignalering – to sentrale kjennetegn ved hepatisk encefalopati og retinopati. Dette bekreftes av at inaktivering av SN1 i mus fører til patologi forenlig med lever encefalopati. Til slutt undersøkte vi en musemodell for hepatisk encefalopati og retinopati. Den viser signifikant reduksjon i SN1, mens SAT2 ikke ble påvirket. Disse dataene stadfester derfor en sentral rolle for SN1 ved utvikling av hepatisk encefalopati og retinopati (Hamdani et al., FASEB J, 2021). SN1 regulering Yeast two-hybrid screening ved bruk av SN1 N-terminal aminosyresekvens som agn identifiserte et interagerende protein (P1). Ko-immunpresipiteringsforsøk under fysiologiske betingelser i forskjellige transfekterte mammalske cellelinjer (slik som CHO, HEK293T og HepG2) og primære kortikale cellekulturer bekrefter slik interaksjon. Det motsatte skjer også: når P1 blir brukt som agn presipiteres SN1. Dette er ytterligere bekreftet ved bruk av Proximity Ligation Assays: et immunofluorescence merkingssystem basert på sekundære antistoff koblet til nukleotider som blir amplifisert dersom to proteiner er i umiddelbar nærhet, det vil si interagerer med hverandre. Det mest interessante er at når vi bruker P1 som agn, isolerer vi ikke bare SN1, men også flere andre membranproteiner. Dette tyder på at det finnes proteinkonglomerater som fin-regulerer SN1 for optimal funksjon i hjernen og retina. Til slutt har vi injisert in vitro transkribert mRNA for SN1 og P1 i Xenopus laevis oocytter for å vise mekanistisk hvordan P1-SN1 interaksjonen regulerer SN1 transport og ekspresjon. Dette vil avsløre hvordan SN1 regulerer signalstoffdannelse og synaptisk plastisitet og hvordan dysfunksjon kan bidra til patologi (MS in prep). Vi har derfor delvis oppnådd våre del-/hovedmål om å demonstrere hvordan glutamintransportører regulerer signalstoffdannelse og bidrar til synaptisk plastisitet og patologi. Dette arbeidet gir også innsikt i patofysiologi og avslører potensielle terapeutiske mål. Dette prosjektet har gitt innsikt i molekylære mekanismer involvert i SN1 funksjon og patofysiologi og avslører potensielle terapeutiske mål. Vårt mål er å translatere disse funnene. Spesielt vil vi se på muligheten for hensiktsmessige endringer i behandling av pasienter med f.eks. hepatisk encefalopati eller hepatisk retinopati. Vi vil teste muligheten for innovering av medikamenter som kan regulere SN1 funksjon.