Proteinkompleks involvert i mammalsk DNA-reparasjon

Dannelse og prosessering av uracil i det humane genom: Molekylær regulering av enzymene activation-induced cytidine deaminase og uracil-DNA glycosylase. Den genetiske informasjonen til en organisme er lagret i DNA (deoksyribonukleinsyre) og nedarves fra generasjon til generasjon. DNA består av deoksyribose, fosfat og fire nitrogenbaser [(adenin (A), cytosin (C), guanin (G) og tymin (T)]. Rekkefølgen på disse basene utgjør kjernen i den genetiske koden. Lenge trodde en at DNA var et kjemisk stabilt molekyl, men dette har vist seg ikke å være tilfelle. DNA kan skades av både indre faktorer, som produkter av cellemetabolismen, og fra ytre faktorer, som ulike kjemikalier, UV- og ioniserende stråling. Dersom disse skadene ikke blir reparert før DNA-replikasjon, vil det kunne føre til mutasjoner, arvelig sykdom, tidlig aldring og kreft. I levende celler finnes flere ulike DNA-reparasjonssystemer som fjerner de fleste av skadene. Disse involverer mange enzymer og proteiner som arbeider sammen for å reparere skadene i DNA. Feil i slike reparasjonssystemer vil derfor også kunne føre til tidlig aldring og sykdom, men gir også grunnlag for genetisk variasjon og evolusjon. En av de vanligste reparasjonsprosessene er DNA-baseeksisjonsreparasjon (BER). Et skadespesifikt enzym, DNA glycosylase, detekterer her en skadet eller feilparet nitrogenbase, binder denne i et strukturtilpasset aktivt sete og kløyver bindingen mellom basen og deoksyribosen. Dette er det første trinnet i en fler-trinns enzymatisk prosess hvor målet er å gjenopprette den opprinnelige sekvensen. Uracil er en base som normalt bare finnes i RNA (ribonukleinsyre), men den kan også forekomme i DNA. Dette skjer enten ved at den feilinnsettes i DNA under replikasjon i stedet for tymin eller ved at den dannes ved deaminering av cytosin. Uracil kan fjernes fra DNA av fire humane uracil DNA glycosylaser; MBD4, TDG, SMUG1 og UNG. Den kvantitativt dominerende av disse er UNG, og den finnes i både mitokondrier (UNG1) og i cellekjernen (UNG2). Selv om BER kan rekonstitueres med bare 4 rensede enzymer in vitro, er mer enn 20 proteiner involvert når dette foregår inne i cellene. Aktiviteten til ulike proteiner kan reguleres av ulike post-translasjonelle proteinmodifikasjoner, som fosforylering og ubiquitinylering. I artikkel I har vi vist at human UNG2 både er fosforylert og ubiquitinylert, og at dette påvirker proteinets levetid, interaksjon med andre proteiner og enzymatisk aktivitet. Selv om UNG er mest kjent som et enzym som er viktig for reparasjon av DNA skader, vet vi nå at enzymet også er involvert i å generere mutasjoner i gener som koder for antistoffer (immunglobuliner). Dette er en viktig del av det mammalske immunforsvaret, som fungerer som en beskyttende barriere både mot eksterne og interne faktorer. Det ervervede immunforsvaret er under konstant utvikling, og B cellenes produksjon av høy-affinitets antistoffer er en viktig del av dette. Antistoffgenene modifiseres gjennom prosessene V(D)J-rekombinering, somatisk hypermutasjon og klasseskift rekombinering, der mutasjoner introduseres med høy frekvens. De to siste av disse prosessene initieres av enzymet activation-induced cytidine-deaminase (AID) som aktivt deaminerer cytosin til uracil. AID er svært mutagent, og det er derfor meget viktig å kontrollere aktiviteten og lokaliseringen av enzymet. En variant av UNG, med en mutasjon i aminosyre 88 (UNG2-R88C), har tidligere blitt funnet i en pasient med hyper-IgM-syndrom. Denne varianten er også registrert i NCBI SNP-databasen med en heterozygot frekvens på 0.003 i en kohort på >1500 personer. I artikkel II har vi studert dette proteinet med hensyn på aktivitet, proteinuttrykk og stabilitet. Vi har også sammenlignet lokalisering av mutert og villtype protein samt binding til andre proteiner som replikasjonsprotein A (RPA) og proliferating cell nuclear antigen (PCNA). I artikkel III har vi studert reguleringen av AID og hvordan importen inn til cellekjernen og nukleoli er regulert. Dette har vi gjort ved å produsere rekombinante, muterte former av AID, og å studere effektene av de ulike mutasjonene på blant annet lokaliseringen av AID. x