Autophagy

AutofagiProsjektet studerer proteiner, organeller, mekanismer og reaksjonstrinn involvert i animalsk autofagi, en mekanisme for intracellulær cytoplasma-nedbryting som regulerer cellevekst og celledød, bl.a. i forbindelse med kreft, og som beskytter celler mot langvarig sult og stress, giftstoffer/medikamenter, infeksjoner, hjerteinfarkt og degenerative nerve-og muskelsykdommer (Alzheimer's m.fl.).Gjennom proteomisk analyse av rensede autofagosomer fra rotte-leverceller, der MALDI-TOF- og ionefelle-massespektrometri er blitt brukt i kombinasjon med flerdimensjonal proteinfraksjonering og immunoblotting, har prosjektet identifisert et førtitalls proteiner som er selektivt assosiert med autofage membraner. De fleste av disse er membranbundne former av kjente cytosol-proteiner, som gjennom massespektrometrisk strukturanalyse i flere tilfelle er funnet å representere nye, proteolytisk trunkerte, N-acetylerte eller fosforylerte proteinvarianter. Prosjektet har i 2007 spesielt vært konsentrert om fire delprosjekter: (1) Karakterisering av nye BHMT-varianter. Ved å benytte todimensjonal immunoblotting med et spesifikt antistoff mot ett av de autofagosomale membranproteinene, BHMT (betain:homocystein-metyltransferase), har vi kunnet identifisere en rekke nye varianter av BHMT, anriket ved flerdimensjonal proteinfraksjonering og verifisert med massespektrometrisk strukturanalyse. Disse er proteolytisk trunkerte BHMT-fragmenter som dels er dannet i cytosol, dels intralysosomalt etter autofagi av prekursor-proteiner (full-lengde eller moderat fragmentert BHMT). Et lite N-terminalt BHMT-fragment (p10) dannes v.hj.a. en lysosomal serin-proteinase og degraderes raskt videre av en lysosomal cystein-proteinase. Ved å hemme den sistnevnte kan akkumulering av p10 i lysosomer måles ved immunoblotting, noe som gir et unikt assay for måling av autofag-lysosomal aktivitet i hele celler. Videre studier vil undersøke om det kan påvises individuelle forskjeller i den autofage behandlingen av BHMT-fragmentene. Et BHMT-manuskript er nesten ferdigskrevet, og vil bli sendt inn med det første. (2) Karakterisering av nye varianter av det autofagosomale membranproteinet catechol-O-metyltransferase (COMT). COMT er et viktig enzym i metabolismen av viktige medikamenter (f.eks. levodopa som bukes i behandling av Parkinson's sykdom), og det bør derfor være av betydelig medisinsk interesse at vi nå, v.hj.a. todimensjonal et egenprodusert COMT-antistoff og massespektrometrisk verifikasjon, har kunnet identifisere 7 forskjellige COMT-varianter som viser et vevs-spesifikt fordelingsmønster. Vi har påvist både N-acetylerte og fosforylerte COMT-former, bl.a. i lever og hjerne, der COMT er av særlig farmakologisk betydning. Et COMT-manuskript er innsendt til publikasjon. (3) Kartlegging av autofag membransyklus. V.hj.a. et egenprodusert antistoff mot LC3 (en markør for autofage membraner), samt hemmere av de forskjellige trinnene i autofagien, er vi i gang med å studere hvordan autofage membran-elementer syklerer fra fagoforer gjennom autofagosomer, amfisomer og lysosomer og tilbake til fagoforer. I motsetning til hva som tidligere har vært antatt, finner vi at de autofage membranene er stabile, og resyklerer uten nevneverdig degradering i lysosomene. Vi finner også at lipidering av LC3, som har vært antatt å korrelere med autofag aktivitet, er konstitutiv i hepatocytter gjennom hele autofagisyklus. Vi er nå i gang med å rense og analysere de forskjellige autofage organellene (fagoforer, autofagosomer, amfisomer og lysosomer) for å se i hvilken grad våre påviste autofagosomale membranproteiner følger LC3-merkede autofage membraner gjennom autofagisyklusen. (4) Flerdimensjonal proteinfraksjonering for rensing og karakterisering av autofage og autofagi-regulerende proteiner. Vi har utarbeidet et skjema for flerdimensjonal proteinfraksjonering, der vi benytter kombinasjoner av høy-kapasitets-væskefase-isoelektrisk fokusering (LP-IEF), revers-fase (hydrofob) væskekromatografi (RP-LC) og én- eller todimensjonal polyacrylamid/SDS-gelelektroforese (PAGE) til å anrike fåtallige proteiner i tilstrekkelig mengde for identifikasjon og karakterisering v.hj.a. massespektrometri. Ved å bruke både MALDI-TOF-MS og ESI-IT-MS/MS til analyse av tryptiske peptider kan vi oppnå en svært høy sekvensdekningsgrad. Vi har brukt metoden bl.a. til karakterisering av BHMT- og COMT-fragmenter, og holder nå på med å rense og analysere fosforylerte varianter av AMPK (AMP-aktivert proteinkinase), et viktig enzym i regulering av autofagi.