Identifying the autoantigen in rheumatoid arhritis
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 3a-183
- Ansvarlig person
- Ludvig M. Sollid, professor
- Institusjon
- Oslo universitetssykehus HF
- Prosjektkategori
- Forskningsprosjekt
- Helsekategori
- Inflammatory and Immune System
- Forskningsaktivitet
- 2. Aetiology
Rapporter
Projektet har har som målsetning å karakterisere spesifisititen til antistoffer som reagerer med citrullinerte antigener og som er typisk for pasienter med revmatoid artritt.Bakgrunn
Revmatoid artritt (RA) er en kronisk revmatisk betennelse i ledd. Påvisningen av antistoffer mot citrullinerte proteiner (ACPA) representerer et paradigme-skifte i forskning på RA. Disse antistoffene er spesifikke for sykdommen og predikerer sykdomsutvikling. Identiteten til antigenet(ene) disse antistoffene gjenkjenner er fortsatt ukjent. I dette prosjektet søkte vi å identifisere autoantigenet(ene) ACPA reagerer mot ved å bruke klassisk immunkjemi og moderne massespektrometri. Som kilde for ACPA ville vi bruke humane monoklonale antistoffer fra B-celler isolert fra ledd/blod eller høy titret polyklonale sera.
Delmål
1. Isolere og lagre B-celler fra blod/leddvæske samt sera og ledd-vev fra ACPA positive RA pasienter. 2. Generere monoklonale B-celle linjer (antistoffer) fra disse pasientene. 3. Generere affinitets kolonner med monoklonale antistoffer, eller høy titrede sera. 4. Rense antigen fra ledd vev/-væske som er fanget på affinitets kolonner. 5. Analysere antigen(er) ved massespektrometri. 6. Teste identifiserte peptider og antigener for reaktivitet mot pasient sera. 7. Spesifikk isolering/eluering av ACPA-autoantigen
Resultater
1. Identifisering og isolering av pasient materiale
Det er fremskaffet og lagret B-celler, sera, ledd-væske og ledd-vev fra en rekke RA pasienter med høye titer av antistoffer mot ACPA. Selv med stor velvilje og innsats fra vår samarbeidspartner Revmatologisk avdeling, Diakonhjemmet v/Tore Kvien, har begrenset tilgjengelighet av egnet pasientmateriale forsinket prosjektet. Det var nødvendig med en jevn tilgang og et stort antall pasient prøver for å få etablert og testet ut alle metodene som var aktuelle for prosjektet.
2. Generering av citrulline-reaktive humane monoklonale antistoffer
Dette arbeidet viste seg å være mer utfordrende enn antatt. Vi har etablert en rekke metoder, nødvendige for å nå målet om å etablere citrulline-reaktive B-celle kloner fra ledd-væske/blod: flowcytometri sortering av hukommelse B-celler, optimalisert og titrert EBV supernatant, EBV transformering av B-celler, ELISPOT av hukommelse B-celler, hybridom produksjon og kloning.
Det er generelt lite viten om frekvens av antigen-spesifikke hukommelse B-celler ved kroniske autoimmune sykdommer. Dette er viktig både for å isolere cellene, men også avgjørende for hvorledes monoklonale antistoffer best fremstilles i laboratoriet. Det er etablert ELISPOT med mitogen stimulering for kvantifisering og lokalisering av spesifikke hukommelse B-celler i pasient materialet. For å evaluere alle etablerte metoder ble det nødvendig å etablere et kontroll system. Vi valgte å immunisere en forsøksperson med tetanus for å produsere anti-tetanus monoklonale B-celler og antistoffer. Metodene er tilfredsstillende uttestet i dette systemet
3. Generering av affinitets kolonner med citrulline reaktive (ACPA) antistoffer
En velfungerende prosedyre er utarbeidet i et flowcytometri basert mikrosystem med paramagnetisk kule matrix. Prosedyren i stor skala er ikke uttestet med anti-citrulline antistoffer.
4. Rense antigen fra ledd vev/-væske som er fanget på affinitets kolonner.
Det har vært arbeidet med ulike prosedyrer for fraksjonering av autoantigen holdig synovial væske/vev for å redusere kompleksiteten og forenkle rensing av antigen. Siden monoklonale antistoffer ikke er generert, er dette arbeidet ikke ferdig.
5. Ikke påbegynt
6. Ikke påbegynt
7. Spesifikk isolering/eluering av ACPA-autoantigen
Det er undersøkt hvorvidt det kan frembringes et spesifikt eluerings system der autoantigen fanget på affinitets kolonne kan elueres av med citrulline inneholdenende universal substanser. Det er testet ut et bredt spekter av substanser. Ingen av de testede substanser var i stand til å eluere av antistoffene.
Sammendrag
Prosjektet er forsøkt løst ved flere parallelle tilnærmingsmåter for å nå hovedmålet. Det er utviklet en rekke metoder samt ny kompetanse i forskningsgruppen. Prosedyre for transformering og dyrkning av lav-frekvente humane monoklonale B-celler er en viktig nyvinning. Ved ny finansiering vil denne kompetansen kunne bidra til å sikre suksess ved gjenopptak av dette prosjektet. Postdok-kandidaten Anders Fallang har ingen publiserte forskningsresultater knyttet til prosjektet ved prosjektets slutt.
Antistoffer mot citrullinerte proteiner (ACPA) er spesifikke for RA. I dette prosjektet søker vi å finne identiteten til antigenet(ene) disse antistoffene gjenkjenner. Affinitets kolonner av genererte humane ACPA monoklonale antistoffer vil bli brukt til å isolere antigen fra pasient materiale, for videre identifisering ved tandem masse spektrometri.Reumatoid artritt (RA) er en kronisk revmatisk betennelse i ledd. Denne betennelsen kan ofte føre til gradvis ødeleggelse av leddene. Den revmatiske betennelsen kan også finnes i indre organer (lunger, hjerte, nyre, nerver, blod, hud, øye). Omkring 1% verdens befolkning får RA. Påvisningen av antistoffer mot citrullinerte proteiner (ACPA) representerer et paradigme skifte i forskning på RA. Disse antistoffene er spesifikke for RA og predikerer sykdoms utvikling. Til tross for viktigheten av dette funnet er identiteten til antigenet(ene) disse antistoffene gjenkjenner fortsatt ukjent. I dette prosjektet søker vi å identifisere dette autoantigenet(ene) ved å bruke klassisk immunkjemi og moderne massespektrometri. Som kilde for ACPA vil vi generere humane monoklonale antistoffer fra B-celler isolert fra ledd/blod eller høy titret polyklonale sera. Affinitets kolonner av slike antistoffer vil bli brukt til å isolere antigen fra synovial væske eller ledd-vev homogenat. Identiteten til antigenet(ene), isolert ved hjelp av disse antistoffene, vil bli identifisert ved tandem masse spektrometri.
Delmål
1. Isolere og lagre leukocytter fra blod/leddvæske samt sera og ledd-vev fra ACPA positive RA pasienter.
2. Generere monoklonale B-celle linjer (antistoffer) fra disse pasientene.
3. Generere affinitets kolonner fra monoklonale antistoffer, eller høy titrede sera.
4. Rense antigen fra ledd vev/-væske som er fanget på affinitets kolonner.
5. Analysere antigen(er) ved massespektrometri.
6. Teste identifiserte peptider og korresponderende antigener for reaktivitet mot pasient sera.
Fremdrift
1. Identifisering og isolering av pasient materiale
Det er fremskaffet og lagret leukocytter (B celler), sera, ledd-væske og ledd-vev fra en rekke RA pasienter med høye titer av antistoffer mot ACPA.
2. Generering av citrulline-reaktive humane monoklonale antistoffer
Dette arbeidet har vist seg å være mye mer utfordrende enn antatt. Vi har etablert en rekke metoder (B-celle sorting, EBV B-celle transformering, kloning og hybridom produksjon) som er nødvendige for å etablere citrulline-reaktive B-celle kloner fra ledd-væske/blod. Metodene er nå uttestet i et kontrollsystem og fungerer etter forventning. Det pågår en storstilt dyrkning og screenings arbeide av humane B celler fra RA pasienter. Det er utarbeidet et ELISA for screening og identifisering av citrulline-reaktive B-celler. Vi har stor tro på at dette skal la seg gjennomføre.
3. Generering av affinitets kolonner basert på citrulline reaktive antistoffer fra RA pasienter
Prosedyre utarbeides i et flowcytometri basert mikrosystem med paramagnetisk kule matrix, for å minske forbruk av serum og kjemikalier. Dette skal siden oppskaleres. Det undersøkes p.t. hvorvidt det kan frembringes et spesifikt eluerings system; Citrulline inneholdende substanser som spesifikt kan eluere av autoantigen fanget på affinitets kolonne. Det er testet ut et lite antall substanser, og flere substanser vil bli testet i umiddelbar fremtid. Metoden er tenkt publisert i internasjonalt tidskrift.
Prosjektet har krevd etablering av en rekke metoder og det foreligger derfor ingen publiserte forskningsresultater hittil i prosjektet.
I Reumatoid Artritt er det påvist spesifikke antistoffer, mot citrullinerte proteiner, som predikerer sykdoms utvikling. Identiteten til antigenet(ene) disse antistoffene gjenkjenner er ukjent. Dette prosjektet søker å identifisere dette autoantigenet(ene).SAMMENDRAG AV PROSJEKTET OG OPPNÅDDE FORSKNINGSRESULTATER I 2007
Reumatoid Artritt (RA) er en kronisk revmatisk betennelse i ledd. Denne betennelsen kan ofte føre til gradvis ødeleggelse av leddene. Den revmatiske betennelsen kan også finnes i indre organer (lunger, hjerte, nyre, nerver, blod, hud, øye). Omkring 1% verdens befolkning får RA. Kvinner rammes oftere enn menn (3:1). Påvisningen av antistoffer mot citrullinerte proteiner (ACPA) representerer et paradigme skifte i forskning på RA. Disse antistoffene er spesifikke for RA og predikerer sykdoms utvikling. Til tross for viktigheten av dette funnet er identiteten til antigenet(ene) disse antistoffene gjenkjenner fortsatt ukjent. I dette prosjektet søker vi å identifisere dette autoantigenet(ene) ved å bruke klassisk immunkjemi og moderne massespektrometri. Som kilde for ACPA vil vi bruke høy titret polyklonale sera samt generere humane monoklonale antistoffer fra B-celler isolert fra ledd. Affinitets kolonner av slike antistoffer vil bli brukt til å isolere antigen fra synovial væske eller ledd-vev homogenat. Identiteten til antigenet(ene), isolert ved hjelp av disse antistoffene, vil bli identifisert ved tandem masse spektrometri.
DELMÅL
Identifisere høy titrede ACPA sera og ledd vev/-væske fra ACPA positive RA pasienter:
Generere monoklonale B-celle linjer (antistoffer) fra disse pasientene.
Generere affinitets kolonner fra høy titrede sera eller monoklonale antistoffer.
Rense antigen fra ledd vev/-væske som er fanget på affinitets kolonner.
Analysere antigen(er) ved massespektrometri.
Test identifiserte peptider og korresponderende antigener for reaktivitet mot pasient sera.
FREMDRIFT
Identifisering av høy titrede pasient sera og autoantigen kilde:
Det er fremskaffet og lagret en rekke polyklonale sera fra RA pasienter med høye titer av antistoffer mot ACPA. Det er også lagret ledd-vev og -væske, fra ACPA positive RA pasienter, som autoantigen kilde.
Generering av citrulline-reaktive humane monoklonale antistoffer
Det er utarbeidet et ELISA for screening og identifisering av citrulline-reaktive B-celler: Vi har arbeidet med å etablere citrulline-reaktive B-celle linjer fra ledd-væske, så langt uten suksess. Det er etablert kontakt med en forskningsgruppe i Sveits (Prof. Antonio Lanzavecchia) som er verdensledende i å lage humane monoklonale antistoffer. Vi mener at deres erfaring, samt intern samkjøring av to prosjekter med beslektede mål skal sikre at denne delen av prosjektet lykkes.
Generering av affinitets kolonner basert på citrulline reaktive antistoffer fra RA pasienter:
Prosedyre utarbeides i et flowcytometri basert mikrosystem med paramagnetisk kule matrix, for å minske forbruk av serum og kjemikalier. Dette skal siden oppskaleres. Det undersøkes p.t. hvorvidt det kan frembringes et spesifikt eluerings system; Citrulline inneholdende substanser som spesifikt kan eluere av autoantigen fanget på affinitets kolonne. Det er testet ut et lite antall substanser, og flere substanser vil bli testet i umiddelbar fremtid.
Prosjektet krever mye etablering av metoder og det foreligger derfor ingen publiserte forskningsresultater så tidlig i prosjektet.
Vitenskapelige artikler
Stensland Maria E, Pollmann Sylvie, Molberg Øyvind, Sollid Ludvig M, Fleckenstein Burkhard
Primary sequence, together with other factors, influence peptide deimination by peptidylarginine deiminase-4.
Biol Chem 2009 Feb;390(2):99-107.
PMID: 19040354
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til eRapport