RNAi silencing of gene expression applied to DNA repair

Identifisering av cellesyklus-regulerte gener i HaCaTUkontrollert celledeling kan føre til mange ulike sykdommer, deriblant kreft. Ved å studere hvordan normale celler oppfører seg gjennom cellesyklus, kan man forstå opphavet til slike sykdommer. I lys av dette har vi studert HaCaT-celler og identifisert cellesyklusregulerte gener.Målet for prosjektet var å identifisere cellesyklusregulerte gener og relatere disse til ulike genomiske og epigenetiske egenskaper. Epigenetikk omhandler arvelige forandringer i genuttrykk eller fenotype som er forårsaket av andre mekanismer enn endringer i selve DNA-sekvensen. Slike forandringer vil vare gjennom celledelinger og generasjoner, og vil påvirke visse gener enten ved at de slås på eller skrus av. Til nå er HeLa, ei cellelinje fra livmorhalskreft, den eneste humane cellelinja hvor sykliske gener er studert. Det er imidlertid uklart i hvilken grad celletype-spesifikke faktorer påvirker forskjellene i sykliske gener. For å teste dette, benyttet vi HaCaT-celler som er humane keratinocytter. Cellene ble synkronisert med dobbel-thymidine blokk og frigjort i G1/S-overgangen av cellesyklus. Synkroniseringen gav svært reproduserbare resultater, der 90 % av cellene var synkrone i første cellesyklus og 70 % i andre. Med tre biologiske replikater var dette et godt utgangspunkt for våre analyser. Vi identifiserte over 1000 cellesyklus-regulerte gener og sammenlignet disse med tidligere publiserte data. Noen av genene var felles med tidligere studier, mens andre igjen var spesifikke for den cellelinja vi jobbet med. Genene som var felles omfattet «housekeeping»-gener med kjente funksjoner i cellesyklus, mens de spesifikke genene som ble identifisert for HaCaT, var viktige for normal celledeling av keratinocytter og var involvert i sårheling. I tillegg identifiserte vi et sett av gener som hadde histonmodifikasjonen H3K27me3 som er assosiert med epigenetisk stille gener. Vi observerte at disse genene var svakt uttrykt under DNA-replikasjonen (S-fasen) og ikke uttrykt i andre cellesyklusfaser. De samme resultatene fant vi også i HeLa-celler synkronisert med dobbel-thymidine blokk og nocodazole etterfulgt av mitotisk seleksjon. Dette viser at resultatene våre gjelder for ulike celletyper og at de ikke er avhengige av hvilken synkroniserings-metode som blir benyttet. I denne studien identifiserte vi en assosiasjon mellom DNA-replikasjon og transkripsjon av epigenetisk stille humane gener. Vi foreslår at DNA-replikasjon kan åpne opp noen epigenetiske stille områder i genomet for transkripsjon, og at dette er viktig for videreføring av visse histonmodifikasjoner til neste celledeling. Dette arbeidet ble sendt inn til tidsskriftet Genome Research i desember 2011.

Mange microRNA molekyler regulerer DNA reparasjon ved UNG2Base eksisjons reparasjonsenzymet UNG2 er en DNA glycosylase som fjerner uracil fra DNA, en base som normalt ikke skal være der. UNG2 er viktig for å unngå mutasjoner i arvematerialet og for adaptiv immunitet. Vi har nå funnet at minst 3 microRNA molekyler regulerer nivået av UNG2 i cellen.Doktorgradskandidaten, Siv Anita Hegre, er nå ute i fødselspermisjon. Før dette har hun bidratt sentralt til utarbeidelse av to manuskripter som oppsummererer resultatene i prosjektet så langt. Hun er henholdsvis førsteforfatter og delt førsteforfatter på disse arbeidene. MicroRNA er små enkelttrådetete RNA molekyler med lengde ca. 22 nukleotider. Den funksjonelle enheten består av et RNA molekyl i kompleks med protein (f.eks. Argonaut 2). Det ene arbeidet har identifisert flere bindindgsseter for 3 microRNA molekyler i den delen av mRNA som ikke koder for aminosyrer, den såkalte 3' utranslaterte regionen (3'UTR) i mRNA. Dise microRNA molekylene er miR-16 (3 bindingsseter) miR-34c (9 bindingsseter) og miR-199a (4 bindingdsseter)ble funnet å nedregulere UNG2 mRNA nivået og proteinnivået av UNG2 i 3 humane kreftcellelinjer. Dette bidrar sannsynligvis til cellesyklus-reguleringen av UNG2. Denne reguleringen ble vist å være avhengig av 3'UTR delen av mRNA. Det er også viktig at disse microRNA molekylene kodes for av introner i gener som er motsatt regulert i forhold til UNG2, noe som passer godt med deres funksjon i cellesyklus-reguleringen av UNG2. Som en utvidelse av dette arbeidet har vi studert cellesyklus-reguleringen av alle kjente humane microRNA molekyler.I tillegg har vi undersøkt cellsyklus-regulering av noen av protein-komponentene som inngår i kompleks med microRNA, herunder Argonaut 2 som ble funnet å være cellesyklusregulert. Det er derfor sannsynlig at noen av de microRNA molekylene som ikke er cellesyklusregulert likevel kan være cellesyklusregulert gjennom proteindelen, som er essenssielt for å danne et funksjonelt kompleks. Siv Anita Hegre har kommet så langt i prosjektet at hun med sikkerhet vil bli ferdig med en doktorgrad.

Identifisering av cellesyklus-regulerte gener og microRNARiktig regulering av cellesyklus er nødvendig for vekst og utvikling av alle organismer. Det å forstå denne reguleringen er sentralt i mange ulike sykdommer, deriblant kreft, hvor defekt cellesyklus-regulering er et fundamentalt trekk. Vi har i dette prosjektet identifisert cellesyklus-regulerte gener og microRNA.Når normale vevsprøver sammenlignes med kreftprøver ved microarray-analyser, vil den største forskjellen vanligvis ligge i uttrykksnivået av gener som kontrollerer celledeling. Vårt prosjekt omhandler identifisering av både gener og microRNA (miRNA) som er cellesyklus-regulerte, og som dermed kan påvirke cellevekst. Karakterisering av hva som regulerer en normal cellesyklus er viktig for å forstå hva som fører til blant annet kreft. Vi har fokusert både på cellesyklus-regulerte gener og miRNA, korte ikke-kodende RNA-molekyler som nedregulerer genekspresjon. Alle krefttyper som er analysert ved miRNA-profilering har vist en signifikant forskjell i miRNA-uttrykket sammenlignet med normale celler fra samme vev. miRNA har også blitt vist å være involvert i cellesyklus-regulering. Vi har valgt å bruke microarray-teknologi for å identifisere gener og miRNA som er cellesyklus-regulerte og som dermed kan være involvert i genomstabilitet og celledeling. For å identifisere cellesyklus-regulerte gener og miRNA, må celler først synkroniseres ved en form for arrest for deretter å samles for analyse ved bestemte tidspunkt etter frigjøring. Det finnes flere metoder for å synkronisere humane cellelinjer. Vi valgte å bruke dobbel-thymidine blokk for å arrestere celler i S-fase og Nocodazole sammen med mitotisk seleksjon for å arrestere celler i mitose. Hvor synkron cellepopulasjonen er, ble bestemt ved flow cytometry. Vi benyttet to humane cellelinjer, HeLa, som er ei cellelinje fra livmorhalskreft og HaCaT som ikke er ei kreftcellelinje men mer ”normal”. Vi isolerte RNA og kjørte gen- og miRNA-ekspresjons profilering med teknologi henholdsvis fra Illumina og Exiqon. Etter en integrert analyse for begge cellelinjene og synkroniserings-metodene, sitter vi igjen med rundt 1000 signifikante cellesyklus-regulerte gener, og et tjuetalls signifikante cellesyklus-regulerte miRNA. Teknologien som ble benyttet for genekspresjon er velkjent og godt etablert. For miRNA derimot er det større problemer både ved valg av teknologi og ved analyse av data. Vi jobber per i dag med validering av de signifikante cellesyklus-regulerte genene og miRNA vi har identifisert. Vi jobber også med prediksjoner for hvilke gener miRNA potensielt kan være med på å regulere. Formålet med prosjektet er å bidra til en bedre forståelse av de mekanismene som ligger bak feilregulert celledeling, som ved f. eks kreft. Deler av arbeidet ble presentert på Keystone Symposia ”MicroRNA and Cancer” i Keystone (USA) i juni 2009. I løpet av 2010 vil vi publisere flere artikler med bakgrunn i de datasettene vi her har utarbeidet.

RNAi nedregulering av genuttrykk relatert til DNA-reparasjonOppdagelsen av ikke-kodende RNA gener og deres rolle i sekvensspesifikk genregulering, såkalt RNA-interferens (RNAi), gjør det nødvendig å beherske teknikker innen RNAi ved molekylærbiologisk forskning. Vi har etablert standard RNAi-teknikker og protokoller gjennom prosjektet, til bruk i vår forskningsgruppe samt tilknyttede grupper.Dette prosjektet omhandler bruk av RNA interferens (RNAi) for å studere den funksjonelle rollen til ulike proteiner involvert i base-eksisjonsreparasjon (BER). RNAi er en prosess hvor korte RNA-fragmenter fører til sekvensspesifikk degradering av mRNA eller hemming av translasjon, og dermed nedregulering av genekspresjon. MicroRNA (miRNA) er en gruppe korte, ikke-kodende RNA sekvenser som har vist seg å være involvert i reguleringen av en rekke ulike prosesser som celledifferensiering, proliferering, apoptose og ikke minst kreftutvikling. I dag har alle krefttyper som er analysert ved miRNA-profilering vist en signifikant forskjell i miRNA-uttrykk sammenlignet med normale celler fra samme vev. En slik miRNA-profilering kan være med på å klassifisere ulike krefttyper. Det er i prosjektet lagt hovedvekt på BER-proteinet Uracil-DNA glykosylase (UNG2) som gjenkjenner og fjerner uracil fra DNA, en av de mest vanlige basefeilene i DNA. Det er tidligere vist at UNG2 er regulert av cellesyklus. UNG2-aktiviteten øker sent i første vekstfase (G1)/tidlig i stasjonærfase (S-fase) for deretter å avta sent i S-fase/tidlig i andre vekstfase (G2). Nivået av UNG2-proteinet og mRNA er fullstendig redusert innen 0-3 timer. MicroRNA bindes til ”seed sites” som er lokalisert i 3’utranslatert region (UTR) av mRNA. Bioinformatiske analyser av 3’UTR i UNG2 indikerer at flere miRNA kan være involvert i reguleringen av UNG2 (P. Sætrom and O. Snøve Jr., upubliserte data). De fleste potensielle miRNA som ble funnet er introniske eller lokalisert i nær avstand til nabogener. Introniske miRNA og deres verts-transkript har vanligvis den samme ekspresjonsprofilen, så mRNA-uttrykket til verts- eller nabogener kan gi indikasjon på ekspresjonen av miRNA. I en tidligere cellesyklus-studie (J. Diaz et al., upubliserte data) ble det benyttet microarrays for å identifisere cellesyklus-regulerte proteinkodende gener. Fra disse data er det identifisert introniske miRNA som ligger i cellesyklus-regulerte verts-transkript. Flere av de potensielle miRNA-kandidatene for UNG2 er lokalisert i introner til cellesyklus-regulerte gener. MicroRNA som er uttrykt i S/G2-fase i cellesyklus kan dermed være med på å regulere UNG2-aktiviteten. Vi jobber i dag med tre prioriterte miRNA-kandidater som er plukket ut basert på antall ”seed sites” de har i UNG2 3’UTR, hvilken grad av komplementaritet det er mellom miRNA og UNG2 mRNA, og i hvilken fase av cellesyklus de trolig er uttrykt i. Overuttrykk av disse tre miRNA-kandidatene i fem ulike cellelinjer ved transient transfeksjon med kjemisk syntetiserte miRNA, viser en klar nedregulering i UNG-aktivitet for alle tre kandidatene. For øyeblikket jobber vi med å validere hvorvidt kandidatene virkelig er cellsyklus-regulert. Ved microRNA-ekspresjons profilering av cellesyklus-synkroniserte celler forventer vi ikke bare å validere våre kandidater, men også å avsløre andre potensielt cellesyklus-regulerte miRNA.