Improving individual patient diagnosis and treatment using combined MR and gene

Målet med dette prosjektet var å kartlegge prognostiske faktorer i brystkreftvev ved bruk av HR-MAS MRS og multivariate dataanalyser. Resultatene viste at det finnes metabolske forskjeller mellom tumorer som har positiv og negativ hormonreseptorstatus. I tillegg ble HR-MAS MRS og genekspresjonsanalyser brukt til å kartlegge ulike grupper av brystkreft musemodeller med ulike genetiske profiler. Resultatene viste at det er forskjeller i den glykolytiske aktiviteten og kolinmetabolismen i de ulike gruppene. Det var også god overensstemmelse mellom metabolittkonsentrasjoner og genuttrykk i glykolysen og kolinmetabolismen. I tillegg viste resultatene at brystkreft musemodellene er representative modeller for pasienter i tilsvarende grupper.

Prosjektet har bidratt til en bedre forståelse for hvordan funksjonelle og metabolske kjennetegn gir informasjon om prediktive og prognostiske faktorer hos brystkreftpasienter. Denne informasjonen vil i framtida kunne bidra til bedre og mer individualisert kreftbehandling blant brystkreftpasienter.

Bakgrunn

I dette prosjektet har vi sett på samspillet mellom gener og metabolitter for å identifisere biomarkører i ulike brystkrefttyper og finne potensielle mål for behandling av kreftpasienter. Forskningen er i nært samarbeid med St. Olavs Universitetssykehus og Oslo Universitetssykehus.

I studien har metabolitt- og genuttrykksprofiler til 34 ulike brystkreftmodeller blitt karakterisert. Modellene var etablert ved direkte implantering av brystkreftvev fra pasienter til mus ved Institutt Curie, Paris, Modellene representerer brystkreft fra ulike genetiske subgrupper; luminal-like, basal-like og HER2 positiv brystkreft.

Spesielt fokus i studien har vært på kolinmetabolismen. Forandringer i kolinmetabolisme forekommer ofte i brystkreft, der endrede nivåer av koliner, i tillegg til oppregulering av spesifikke gener som regulerer kolinmetabolismen ofte har blitt assosiert med malign omdanning. High-resolution magic angle spinning (HR-MAS) MR spektroskopi (MRS) er en teknikk som kan brukes til å analysere metabolitter i intakt vev. Ved bruk av mikromatriser kan man måle uttrykket av gener i vevsprøver, og gener som regulerer kolinmetabolismen kan derfor studeres. Flere enzymer involvert i kolinmetabolismen har vist seg å være potensielle mål ved behandling av kreft, men de underliggende reguleringsmekanismene er fortsatt ikke fullt ut forstått.

Resultater

HR-MAS MRS analysene av dyremodellene viste andre kolinmetabolitter i den luminal-like i forhold til den aggressive basal-like subgruppen. Disse resultatene var i overensstemmelse med resultater av vevsprøver fra brystkreftpasienter. Mikromatriseanalysene viste at uttrykk av flere gener var positivt eller negativt korrelert med kolinmetabolittene.

Vitenskapelig betydning

Disse resultatene og tidligere studier av disse brystkreftmodellene indikerer at modellene er relevante for å studere brystkreft. Ved direkte implantering av vev fra menneske til mus bevares i stor grad morfologiske karakteristika, bindevevsstruktur, differensiering og genetiske profiler. I tillegg er det god overensstemmelse mellom respons på behandling i disse modellene og respons hos pasientene som vevet kommer fra. Kolinmetabolismen er fortsatt ikke fullt ut kartlagt og bedre forståelse av de biokjemiske mekanismer som regulerer kolinmetabolismen kan bidra til å finne potensielle mål for behandling av kreftpasienter og velge ut hvilke pasienter som sannsynligvis responderer best på en slik behandling. Flere av disse brystkreftmodellene skal nå etableres ved NTNU og Oslo Universitetssykehus, og flere nye forskningsprosjekter er under planlegging.

Lymfeknute-, østrogen- og progesteronreseptorstatus er viktige prognostiske faktorerer i brystkreft. Disse prognostiske faktorene ble evaluert ved bruk at MR metabolomics. Biopsier fra pasienter (n=160) ble analysert ved bruk av high resolution magic angle spinning MR spektroskopi (HR-MAS MRS). MR spektrene ble prosessert og både trenings- og testsett generert for tre ulike multivariate analysemetoder; PLS-DA (partial least-squares discriminant analysis), PNN (probalistic neural networks) og BBNs (Bayesian belief networks). Modellene ble videre verifisert ved testing av blindprøver (n=50). Østrogen- og progesteronstatus ble best klassifisert med PLS-DA med riktig klassifikasjon i henholdsvis 44 av 50, og 39 av 50 prøver. Lymfeknutestatus ble best predikert med BBN der 34 av 50 prøver ble riktig klassifisert. Resultatene viser at MR-profilene fra brystkreftbiopsier inneholder informasjon som kan være et viktig verktøy for bedre diagnostisering og behandling av brystkreftpasienter.

Tumorceller har økt glykolytisk aktivitet i forhold til normalceller og glukose blir i hovedsak brukt til å produsere laktat og alanine, selv når det er høye konsentrasjoner av oksygen til stede (Warburg effekt). Dette studiet tar utgangspunkt i to ulike dyremodeller der primærtumorvev fra to brystkreftpasient er direkte implantert i mus. Den ene brystkreftformen (luminal-like) antas å ha bedre prognoser enn den andre (basal-like). Hensikten var å studere glukosemetabolismen i de to kreftmodellene ved bruk av 13C HR-MAS MRS og genekspresjonsanalyser. Tumorvev ble samlet både fra ubehandlede mus (N=19) og fra en gruppe mus som hadde fått injeksjon av 13C merket glukose der vevet ble samlet 10 eller 15 minutter etter injeksjonen (N=16). 13C HR-MAS MRS ble utført på hver prøve for å se på omdanningen fra glukose til laktat og alanin. Forskjeller i glukose/alanin (Glc/Ala), glukose/laktat (Glc/Lac) og alanin/laktat (Ala/Lac) ble studert for å se på omdanningen fra glukose. Uttrykk av gener som bidrar i glykolysen ble også studert ved bruk av mikromatriseanalyser.

I de umerkede prøvene ble det observert en signifikant lavere Glc/Ala og Glc/Lac ratio i den luminal-like modellen i forhold til den basal-like modellen (p<0.001). For de glukosemerkede prøvene ble det også observert en signifikant lavere Glc/Ala og Glc/Lac (p<0.05) i den luminal-like modellen. De fleste genene som ble studert var sterkere uttrykt i den luminal-like modellen (p<0.001). Disse resultatene indikerer at omdanningen fra glukose til laktat og alanin skjer raskere i den luminal-like relativt til den basal-like tumormodellen, dette til tross for at den basal-like modellen vokser raskere enn den luminal-like modellen. Resultatene tyder på at tumor veksthastighet ikke nødvendigvis er en avgjørende faktor i forhold til glykolytisk aktivitet. Vi har vist at 13C HR-MAS MRS i kombinasjon med genekspresjonsanalyser kan være et godt verktøy for å studere glukosemetabolisme i kreft.

Vi ønsker videre å studere den glykolytiske aktiviteten til kreftbehandlede mus i de samme tumormodellene og tumorprøver fra mus behandlet med avastin, doxorubicin og østrogenbehandling har blitt samlet og er klar til analyse.

Den metabolske profilen til et større utvalg av brystkreftmodeller (n=30) vil snart bli analysert med HR-MAS MRS. Disse prøvene representerer både luminal-like, basal-like og HER2-amplifisert brystkreft.

Glukose er et molekyl som lett omsettes til energi i de fleste cellene i kroppene. Normalt vev tar opp og nyttiggjør seg av glukose ved behov. Behovet vil være økt for eksempel under trening. Normalt vev vil i stor grad få energi fra glukose ved frigjøring av energi i den såkalte sitronsyresyklusen. Dette krever at det er nok oksygen til stede. Dersom det er mangel på oksygen må cellene i stedet produsere energi ved å omdanne glukose til laktat.

Ved hurtig cellevekst, slik man observerer i kreftvev, vil det også være et økt behov for glukose. I dag er økt glukosemetabolisme i kreft ikke bare observert, men også nyttiggjort både i diagnostikk og i behandling ved bruk Positron Emisjonstomografi (PET). Et av kjennetegnene i kreftvev, er at glukose omdannes til laktat selv om det er rikelige konsentrasjoner av oksygen til stede. Denne effekten kalles Warburg-effekten og ble beskrevet allerede på 30-tallet.

MRS er en metode som blant annet kan anvendes til å se på hvilke forbindelser som finnes i et stoff, og den kan fortelle noe om strukturen i stoffet. Flere atomkjerner er MR-følsomme og en av de mest anvendte atomkjernene i MRS-sammenheng er 13C. 13C MRS er i utgangspunktet en insensitiv teknikk blant annet pga at bare 1,1 % av karbonkjernene forekommer som 13C. Lav naturlig forekomst av 13C-kjerner byr også på noen fordeler. Man kan merke et stoff med 13C-kjerner slik at det blir synlig i 13C MR-spekteret. Deretter kan man injisere dette stoffet i en organisme der det omdannes til nye stoff som også blir synlige i 13C MR-spektre. Dette gjør 13C MRS ideell i studier der man ser på metabolske prosesser.

Det studiet tar utgangspunkt i to ulike dyremodeller, der vev fra primærtumor fra to brystkreftpasient er direkte implantert i mus. De to kreftmodellene er genetisk meget ulike og pasienter som klassifiseres i den ene gruppen antas å ha bedre prognoser (den luminal-like) sammenlignet med pasienter som klassifiseres i den andre gruppen (den basal-like). 13C-merket glukose ble injisert i begge brystkreftmodellene og tumorvev fra begge modellene innsamlet ved to ulike tidspunkt etter injeksjonen slik at glukosen fikk tid til å omdannes til laktat og alanin. Ved bruk av 13C MRS ble så tumorprøvene undersøkt.

Resultatene viser at begge modellene har tatt opp glukose og at det har skjedd en omdanning til både laktat og alanin. Ved å sammenligne de to modellene, ser man at det er forskjeller i hastighet for opptak av glukose og omdanning til laktat og alanin. Den luminal-like modellen, som er den modellen med best prognoser, ser ut til å ta opp glukose og/eller omdanne glukosen til laktat og alanin mye raskere enn den basal-like modellen.

Forskjeller i opptak og omdanning til laktat og alanin kan trolig relateres til gener som bidrar i omdanning. Vi vil forsøke å se på sammenhenger mellom våre resultater og uttrykk av gener som bidrar i denne metabolske prosessen.

Brystkreft er den hyppigst forekommende kreftformen hos kvinner i verden i dag, mens prostatakreft er den vanligste kreftformen hos menn.

Behandling av brystkreft baserer seg på kliniske målinger, hvor histopatologisk vurdering av biopsi, om svulsten har østrogen eller progesteron-reseptorer og om kreftceller har spredt seg til lymfeknutene i aksillen er de viktigste faktorene. Valg av behandling av prostatakreft baserer seg som regel på målinger av prostate specific antigen (PSA) i blod og ved hjelp av histopatologisk vurdering av prostatabiopsi. Kliniske og patologiske data er ofte ikke tilstrekkelige for å forutsi behandlingsrespons og til å sette nøyaktige prognoser da pasientene med relativt like prognoser kan respondere svært ulikt på behandling. Kreftbehandling er ofte en stor påkjenning for pasienten. Metoder for å tidligere kunne forutsi hvem som respondere og en mer individuell behandling er høyst ønskelig.

Metoden high-resolution magic angle spinning magnetisk resonans spektroskopi(HR-MAS MRS) er en ikke-destruktiv teknikk som kan utføres på intakte biologiske prøver. Det resulterende MR-spekteret gir oss et bilde av kreftvevets metabolske profil, dvs. innhold av små metabolitter som for eksempel aminosyrer og sukker. En viktig fordel med denne teknikken er at vevsprøven er intakt, og den metabolske profilen kan derfor sammenlignes direkte med for eksempel patologiske og immunohistokjemiske metoder av nøyaktig samme prøve. Kvantitativ revers transkriptase polymerase chain reaction (Q-PCR) er en metode som kan både brukes til å detektere og å kvantifisere spesifikke RNA-sekvenser. Q-PCR brukes til å kartlegge spesifikke RNA-sekvenser som viser seg å være indikatorer på for eksempel kreftaggressivitet.

NTNU og University of California, San Francisco (UCSF) bruker HR-MAS MRS til å undersøke bryst- og prostataprøver. De to universitetene har et samarbeidsprosjekt og NTNU har hatt flere forskere og stipendiater på utplassering. Doktorgradsstipendiat Maria Tunset Grinde har vært på utveksling til UCSF et halvår (høsten 2008) og har analysert prøver fra pasienter med prostatakreft. Hensikten er å undersøke det diagnostiske potensialet av laktat, alanin og laktatdehydrogenase (LDH).

Tidligere forskningsresultater har vist at laktat og alanin er overuttrykt i prøver med kreft versus normalprøver. Resultatene tyder på at det også på at det er en høyere ekspresjon av laktat og alanin i aggressive prostata kreftformer versus snille kreftformer av prostata.

Studier har også vist en oppregulering av enzymet LDH i blant annet lungekreft. LDH er et enzym som katalyserer i produksjon av laktat og et overuttrykk av LDH kan være et tegn på kreft. Det gjøres nå analyser ved hjelp av Q-PCR for å se om LDH også er oppregulert i prostatakreft og om det er noen sammenheng mellom LDH og laktatnivå.