Gene expression analysis of proliferating cells in the gastric oxyntic mucosa
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 46038700
- Ansvarlig person
- Ingunn Bakke
- Institusjon
- NTNU, IKM
- Prosjektkategori
- korttidsprosjekt 2010
- Helsekategori
- Cancer
- Forskningsaktivitet
- 4. Detection and Diagnosis
Rapporter
Stamcellene i mageslimhinnen gir konstant fornying av de ulike celletypene, samtidig som de bevarer egen populasjon. Denne prosessen er utsatt for feilregulering og kan bidra til betennelse, sår og kreft. Lite er kjent om dens molekylære egenskaper og regulering. Vi har i dette prosjektet utviklet en metode for bruk av laser mikrodisseksjon (LCM) til samling av prøver for storskala genuttrykksanalyser av stamcellesonen. Ett av hovedmålene med å optimalisere alle de ulike trinnene i denne prosessen ble vellykket gjennomført, slik at en god metode overførbar til tilsvarende undersøkelser i andre vev nå er etablert. Deretter var målet å finne en spesifikk genuttrykksprofil for stamcellesonen. Ved bruk av LCM ble det fra frysesnitt, basert på guiding fra et seriesnitt farget med den prolifererende markøren Ki67, skjært ut separate prøvepar fra stamcellesonen og resterende slimhinne fra seks rotter. Robuste mikroarrayresultat viser at metodene for utskjæring og RNA isolering er gode og reproduserbare. Stamcellesonen ble analysert ved å sammenligne med det generelle genuttrykket i resten av slimhinnen for hvert par. Vi har karakterisert hvilke biologiske prosesser som er typisk for denne sonen ved GeneGo, samt laget annoterte lister med gener over- eller underuttrykt (ca 1000 gener) eller «unike» (ca 50 gener) for stamcellesonen. Basert på dette er det plukket ut spesielt interessant stamcellerelaterte gener som nå undersøkes videre, og manuskriptet er i ferd med å skrives.
Molekylær patologi for bedre klassifisering av molekylære subgrupper av ulike krefttyper gjør stadige framskritt og er viktig for økt og bedre individualisert pasientbehandling. Muligheten til å gjøre nøyaktige molekylære undersøkelser i spesifikke celletyper eller bestemte deler av et komplekst vev er blitt betraktelig forbedret ved bruk av laser mikrodisseksjon. Denne teknikken muliggjør rask og presis samling av helt rene prøver fra fryse- eller parafininnstøpte histologiske vevssnitt, fra celleutstryk eller fra dyrkede levende celler. Disse prøvene kan så brukes til en lang rekke videre analyser av proteiner, DNA eller RNA. Vi er ett av få miljø i Norge som har tatt i bruk et nytt slikt utstyr ved vår lab. Bruk av laser mikrodisseksjon til å samle RNA-prøver for storskala genuttrykksanalyser ved hjelp av mikroarray er ekstra utfordrende, siden det da er snakk om innsamling fra veldig lite materialet og det kreves et minimum av både mengde og kvalitet på RNA’et som skal brukes. I dette prosjektet har vi etablert en metode for bruk av laser mikrodisseksjon til samling av prøver fra frysesnitt fra mageslimhinnen, skjært ut basert på guiding fra et farget seriesnitt, hvor man klarer å samle nok RNA med god kvalitet selv fra svært lite materialet. Metoden kan overføres til tilsvarende undersøkelser i andre vev, samt videreføres til bruk på parafininnstøpte biopsier, og er av stor generell interesse og nytte.
Stamcellene i mageslimhinnen gir konstant fornying av de ulike celletypene, samtidig som de bevarer egen populasjon. Denne prosessen er utsatt for feilregulering og kan bidra til betennelse, sår og kreft i magesekken. Lite er kjent om stamcellepopulasjonen i magesekken, og vi har utviklet en metode for å kunne gjøre storskala genuttrykksanalyser av denne.Den prolifererende stamcellesonen i den syreproduserende delen av mageslimhinnen ligger i den øverste tredelen av slimhinnens kjertler, som strekker seg fra overflaten av magesekken og ned til muskellaget. Hver kjertel antas å bli forsynt av sin egen multipotente stamcelle som via differensiering av sine datterceller gir opphav til alle de ulike celletypene med hver sine nøkkelfunksjoner i kjertlene. De molekylære karakteristikaene, genuttrykksprofilen og regulering av stamcellesonen i magesekken er lite studert, og det finnes blant annet ingen kjent stamcellemarkør enda.
Muligheten til å gjøre nøyaktige molekylære undersøkelser i spesifikke celletyper eller bestemte deler av et komplekst vev er blitt betraktelig forbedret ved bruk av laser mikrodisseksjon. Denne teknikken gjør at man raskt og presist kan samle helt rene prøver fra fryse- eller parafininnstøpte histologiske vevssnitt, fra celleutstryk eller fra dyrkede levende celler. Disse prøvene kan så brukes til en lang rekke videre analyser av proteiner, DNA eller RNA. Vi er ett av få miljø i Norge som har tatt i bruk et nytt slikt utstyr ved vår lab.
For å kunne gjøre gode storskala genuttrykksanalyser ved hjelp av mikroarray, kreves det et minimum av både mengde og kvalitet på RNA’et som skal brukes. Dette er en utfordring med laser mikrodisseksjon fordi det da er snakk om å samle veldig små prøver. Våre hovedmål for dette prosjektet har vært først å optimalisere alle de ulike trinnene i prosessen; fra innsamling av det biologiske materialet, preparering og behandling av det før, under og etter laser mikrodisseksjonen, til gjennomføring av mikroarrayprosedyren. Tanken har vært å etablere en metode som fungerer godt og som kan overføres til tilsvarende undersøkelser i for eksempel annet vev. Dette har vi nå gjennomført vellykket i løpet av den første halvdelen av dette prosjektet. Deretter har vi ønsket å lage en genuttrykksprofil for stamcellesonen i den syreproduserende slimhinnen ved å sammenligne genuttrykket i stamcellesonen med det generelle genuttrykket i resten av slimhinnen. Vi har ved hjelp av laser mikrodisseksjon samlet separate prøver fra stamcellesonen og den resterende slimhinnen i 6 forsøksrotter som brukes som modell, og mikroarray av dette er nå i gang. I neste halvdel av prosjektet vil vi bruke bioinformatikk og analysere denne profilen for å se på hvilke typer gener som er opp- og nedregulert, sammenligne med kjente stamcelledatabaser for å se om vi finner en «stamcelleprofil» og gjøre videre undersøkelser av spesielt interessante gener. I tillegg vurderer vi å utvide designet sånn at man også kan se på genuttrykket i stamcellesonen hos rotter med forhøyet nivå av hormonet gastrin, som er kjent å ha en vekstfremmende effekt på slimhinnen, sammenligne med genuttrykket i den andre store populasjonen av celler i mageslimhinnen med evne til proliferasjon (de nevroendokrine ECL cellene) og eventuelt gjenta det opprinnelige forsøket i humant materialet.
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til Helse Midt-Norge RHF - Samarbeidsorganet og FFU