Mechanisms of Toll-like receptor 4 signalling and its regulation

Prosjektnummer: 46048000
Ansvarlig person: Harald Husebye
Institusjon: NTNU, IKM
Prosjektkategori: Forskerstipend 2011
Helsekategori: Inflammatory and Immune System
Forskningsaktivitet: 1. Underpinning

2013

Mechanisms of Toll-like receptor 4 signalling and its regulationFormålet med prosjekter er å beskrive nye molekylære og cellulære aspekter ved TLR4 drevet inflammasjon. TLR4 gjenkjenner Gram-negative bakterier og binder lipopolysakkarid (LPS) som er en hovedkomponent i celleveggen hos disse bakteriene.Ved binding til LPS aktiveres TLR4 og kan nå trigge to alternative signalspor. Signalspor 1 skjer direkte fra celleoverflata og gir produksjon av pro-inflammatoriske cytokiner (som TNF). Signalspor 2 skjer etter endocytose av aktivert TLR4 (LPS-bundet) på intracellulære vakuoler (endosom) der produksjon av type-I interferoner (som IFN-ß) initieres. Signalspor 1 blir i litteraturen referert til som MyD88-avhengig signalering, mens signalspor 2 som MyD88-uavhengig. Vi undersøker her Rab11a GTPasens rolle i MyD88-uavhengig signalering ved bruk av konfokal mikroskopi på levende og fikserte celler. CD14 binder LPS til plasmamembranen og sørger for endocytose av aktivert TLR4 (i kompleks med co-reseptor MD-2 og CD14 ). På endosomene kan komplekset binde endosomal TRAM som i sin tur rekrutterer TRIF. TRIF kan nå starte signalkaskaden som gir IFN-ß produksjon. Dette foregår fra såkalte LPS-endosom. Ved å studere TRAM rekruttering til LPS-endosomene får vi innblikk i hvordan MyD88-uavhengig signalering reguleres. TRAM er tidligere vist å lokalisere til plasmamembranen, trans-Golgi nettverket (TGN) og endosom. Ved overuttykk av Rab11a ser vi at TRAM går inn i det peri-nukleære resykleringsområdet (”the peri-centriolar endocytic recycling compartment”, ERC) og at TRAM blir anriket på endosomene. Ved fjerning av Rab11a funksjon, ved siRNA-behandling eller overtrykk av ikke-funksjonell Rab11a, ser vi at TRAM fanges i TGN og at uttransporten til LPS-endosomene hindres. TRAM-nivået på plasmamembranen ser ut til å være uforandret. Vi ser videre at LPS- endosomene blir mindre og at IFN-ß signaleringen hemmes. Rab11a ser altså ut til å styre transporten av TRAM fra TGN inn i ERC og ut på ut på LPS-endosomene. Videre har vi karakterisert en familie 5 Rab11-bindene proteiner, Rab11-FIP´s, med tanke på om noen av disse selektivt kontrollerer TRAM rekruteringen til LPS-endosomene. Vi finner at en av disse styrer rekruteringen av TRAM fra en intracellulær kilde til LPS-endosomene og at siRNA-behandling mot mot denne faktoren selektivt påvirker MyD88-uavhengig signalering (IFN-ß produksjon). Vi jobber nå med å publisere våre funn i dette prosjektet i form av to publikasjoner.

2012

Mechanisms of Toll-like receptor 4 signalling and its regulationFormålet med prosjekter er å beskrive nye molekylære og cellulære aspekter ved TLR4 drevet inflammasjon. TLR4 gjenkjenner Gram-negative bakterier og binder lipopolysakkarid (LPS) som er en hovedkomponent i celleveggen hos disse bakteriene.Ved binding til LPS aktiveres TLR4 og kan nå trigge to alternative signalspor. Signalspor 1 skjer direkte fra celleoverflata og gir produksjon av pro-inflammatoriske cytokiner (som TNF). Signalspor 2 skjer etter endocytose av aktivert TLR4 (LPS-bundet) på intracellulære vakuoler (endosom) der produksjon av type-I interferoner (som IFN-ß) initieres. Signalspor 1 blir i litteraturen referert til som MyD88-avhengig signalering, mens signalspor 2 som MyD88-uavhengig. Vi undersøker her Rab11a GTPasens rolle i MyD88-uavhengig signalering ved bruk av konfokal mikroskopi på levende og fikserte celler. CD14 binder LPS til plasmamembranen og sørger for endocytose av aktivert TLR4 (i kompleks med co-reseptor MD-2 og CD14 ). På endosomene kan komplekset binde endosomal TRAM som i sin tur rekrutterer TRIF. TRIF kan nå starte signalkaskaden som gir IFN-ß produksjon. Dette foregår fra såkalte LPS-endosom. Ved å studere TRAM rekruttering til LPS-endosomene får vi innblikk i hvordan MyD88-uavhengig signalering reguleres. TRAM er tidligere vist å lokalisere til plasmamembranen, til trans-Golgi nettverket (TGN) og endosom. Ved fjerning av Rab11a funksjon, ved siRNA-behandling eller overtrykk av ikke-funksjonell Rab11a, ser vi at TRAM fanges i TGN og at uttransporten til LPS-endosomene hindres. TRAM-nivået på plasmamembranen ser ut til å være uforandret. Vi ser videre at LPS- endosomene blir mindre og at IFN-ß signaleringen hemmes. Rab11a ser altså ut til å styre transporten av TRAM fra TGN og ut på LPS-endosomene og ikke transporten inn fra plasmamembranen til LPS-endosomene. Vi jobber nå videre med å bekrefte resultatene våre i primærceller som humane monocytter og makrofager. For å videre studere Rab11a funksjon i MyD88-uavhengig signalering ser vi på flere kandidater i gruppen av Rab11 interagerende proteiner. Det er ved binding til disse at Rab11a eventuelt kan styre den intracellulære transporten av TRAM.

2011

Mekanismer for Toll-lignende Reseptor 4 (TLR4) signaleringInflammasjon er en meget potent prosess som kan eskalere og kan bli livstruende hvis den kommer ut av kontroll, sepsis mot Gram- negative eller Gram-positive bakterier er en slike tilstander. Dysfunksjon kan også gi kroniske betennelses tilstander som kan føre til utvikling av diverse sykdomer som revmatoid artritt, aterosklerose, astma, inflammatorisk tarmsykdom, svangerskapsforgiftning med mer.Den primære funksjonen til Toll-lignende reseptorer er å gjenkjenne mikrober som bakterier eller virus når vi blir infisert av disse. De er en familie på 10 medlemmer som binder komponenter som endotoksin, lipoprotein og nukleinsyrer og starter inflammasjons som setter resten av immunforsvaret i stand til å klarere den pågående infeksjonen. Å forstå mekanismene for hvordan Toll-lignende reseptorer virker på cellulært nivå kan gi kunnskap om hvordan dysfunksjon som gir kronisk betennelse oppstår. En slik kunnskap kan videre benyttes til å designe nye medisiner og eventuelt hvordan slike sykdomstilstander kan unngås. Toll-lignende reseptor 4 (TLR4) er en del av første-linje-forsvaret mot bakterielle infeksjoner. Den binder lipopolysakkarid (LPS) som er en hovedkomponent i celleveggen hos Gram-negative bakterier. Ved binding til LPS kan TLR4 drive to hovedsignalspor, ett som gir sekresjon av pro-inflammatoriske cytokiner (signalspor1) og et annet som gir type I interferoner (signalspor2). Vårt fokus i dette prosjektet er å forstå mekanismene for intracellulær transport av TLR4 og hvordan denne er koblet opp de to alternative signaliseringssporene. Vi har nylig vist at rekrutering av TLR4 til bakterier som har blitt spist/fagocytert av makrofager er viktig i modulering av signalspor2 og at GTPasen Rab11a spiller en sentral rolle. Ved hjelp av CD14 kan også løselig LPS bindes til celleoverflaten av makrofager og bli tatt opp ved endocytose sammen med TLR4, for så å samlokalisere på endosomer. Vi prøver nå å finne mekanismen for modulering av signalspor2 på endosomer stimulert av løselig LPS og om GTPasen Rab11a også er viktig her.

Vitenskapelige artikler

Grimstad Øystein, Husebye Harald, Espevik Terje

TLR3 mediates release of IL-1ß and cell death in keratinocytes in a caspase-4 dependent manner.

J Dermatol Sci 2013 Oct;72(1):45-53. Epub 2013 jun 12

PMID: 23845419

Doyle Sarah L, Husebye Harald, Connolly Dympna J, Espevik Terje, O'Neill Luke A J, McGettrick Anne F

The GOLD domain-containing protein TMED7 inhibits TLR4 signalling from the endosome upon LPS stimulation.

Nat Commun 2012;3():707. Epub 2012 feb 28

PMID: 22426228

Husebye Harald

Mechanisms behind toll-like receptor 4 (TLR4) signaling

Winter school 2012 on innate immunity and synthetic biology, March 21-23, Pokljuka, Sloveina.

Husebye Harald

Mechanisms behind TLR4 induced IFN-ß signaling.

5th NorMIC Meeting. October 25-26, 2012. Bergen.

Klein, D., Rebel, E., Espevik, T., Husebye, H.

Frap study of TLR4 dynamics

5th NorMIC Meeting. October 25-26, 2012. Bergen.

Husebye H, Aune MH, Stenvik J, Espevik T

The small GTPase Rab11a is involved in LPS induced IFN-ß production

Konferanse, Deconding Innate Immunity, Riva del Garda, Italy, May 4-7, 2011

Husebye H, Aune MH, Stenvik J and Espevik T et al

The Rab11a GTPase Controls Toll-like Receptor 4-Induced Activation of Interferon Regulatory Factor-3 on Phagosomes

NBS møte Storlien March 31 2011

Espevik T

The Rab11a GTPase regulates TLR4 signaling from the phagosome

Konferanse, Toll2011 Deconding Innate Immunity, Riva del Garda, Italy, May 4-7, 2011

Husebye H, Aune MH, Stenvik J, Espevik T

The small GTPase Rab11a is involved in LPS induced IFN-ß production

Konferanse, ISB retreat, Fort Worden, Washington, September 14-15, 2011

Klein DCG, Rebel E, Espevik T and Husebye H

Dynamics of TLR4 and its adaptor protein TRAM

Konferanse, NorMIC Annual Meeting October 20-21, 2011

Husebye H, Aune MH, Stenvik J and Espevik T et al

The Rab11a GTPase Controls TLR4 - induced activation of interferon regulatory factor-3 on phagosomes

Konferanse, NorMIC Annual Meeting October 20-21, 2011

Deltagere

Harald Husebye Prosjektleder
Terje Espevik Forskningsgruppeleder
Kristian K. Starheim Postdoktorstipendiat
Astrid Skjesol Postdoktorstipendiat

eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT

Alle henvendelser rettes til Helse Midt-Norge RHF - Samarbeidsorganet og FFU

Personvern - Informasjonskapsler