T cell functions in mycobacterial infections and effects of co-infection with HIV

Dette forskningsprosjekt har utvidet forskningen på medfødt immunitet og inflammasjon ved CEMIR/IKM med et prosjekt på adaptiv immunitet og T celleimmunologi. Det har de siste årene blitt mer og mer klart at inflammasjon og medfødt immunitet i stor grad påvirker det adaptive, spesifikke immunforsvaret. Den metodiske kompetansen og resultatene som ble oppnådd i dette forskerprosjektet kommer derfor til å være verdifulle bidrag til framtidig forskning ved CEMIR/IKM. Forskningsprosjektet har bidratt til å utvide forskning fra CEMIR/IKM til mer pasientnær klinisk forskning ved å etablere et samarbeid med St. Olavs Hospital. Samarbeidet styrker infeksjonsforskningen ved det RHF gjennom å initiere forskning på HIV-pasienter i Midt-Norge og undersøker hvordan det er mulig å opprettholde en tilnærmet normal immunrespons hos HIV pasienter som får antiretroviral over lang tid. Studien skal avsluttes og resultater publiseres i videreføring av prosjektet (forskerprosjekt 46056834, Markus Haug). Resultater fra studien kan ha betydning for RHF fordi den kan gi svar på spørsmålet om HIV terapien som brukes per i dag ved St. Olavs Hospital sikrer en tilnærmet normale T cellefunksjoner og sammensetning i HIV pasienter. I tillegg har basalforskningen i dette prosjektet bidratt til bedre forståelse av sykdomsmekanismer i mykobakterie-infeksjoner, sammenhengen mellom HIV og tuberkulose og utvikling av nye vaksinestrategier. Dermed har resultat fra prosjektet bidratt til NTNU/DMF sitt satsingsområde på global helse forskning.

Pasienter som er smittet av HIV vil gradvis utvikle svikt i forsvaret mot infeksjoner. Dette skyldes spesielt tapet av CD4+ T celler som karakteriserer en HIV-infeksjon. CD4+ T celler er en type immunceller som har sentrale funksjoner i det spesifikke immunforsvaret mot infeksjoner. Mens de fleste infeksjoner opptrer hos HIV-infiserte pasienter som har vært smittet i mange år, er risikoen for å utvikle tuberkulose, forårsaket av Mycobacterium tuberculosis, tilstede like etter man ble HIV-smittet. Forsvar mot mykobakterier krever koordinert samhandling mellom medfødte og spesifikke immunmekanismer, men mye er fortsatt ukjent i forhold til hvordan balansen bør være mellom de ulike mekanismene. Det spekuleres i at man tidlig i en HIV-infeksjon mister undergrupper av T celler som er spesielt viktige for å bekjempe mykobakterier. Forbedret kunnskap om hva som gir beskyttende immunitet er nødvendig for rasjonell utvikling av nye og effektive vaksiner mot tuberkulose og andre mykobakterieinfeksjoner. Dette prosjektet har brukt både in vitro og in vivo metoder i en til å analysere forskjellige spesifikke T cellefunksjoner mot mykobakterier i detalj. I tillegg har prosjektet etablert metoder til å måle spesifikke T cellefunksjoner i blodprøver fra HIV pasienter som videre skal brukes i en klinisk pasientstudie. Dette forskerprosjektet ble avsluttet i juli 2014 men støttes siden august 2014 videre i en ny 3 årsperiode. Kunnskap oppnådd i prosjektet vil være viktig for å forstå immunresponsen mot HIV og mykobakterier og for å utvikle gode vaksiner mot tuberkulose. Aktuelle delmål i dette prosjektet: Antimykobakterielle T cellefunksjoner i HIV pasienter: Forskerprosjektet har etablert protokoller for både isolering, kultivering, biobanking og måling av T celle effektorresponsen mot mykobakterier. Siden prosjektet videreføres, vil disse metodene i den nye 3-årige støtteperioden brukes til gjennomføring av en klinisk studie med HIV pasientmateriale fra St Olavs hospital. Studien er REK godkjent og skal undersøke autofagi og anti-mykobakterielle T cellefunksjoner både hos nysmittede og hos behandlede HIV-pasienter. Påvirker HIV-infeksjon autofagi i T celler? I det siste året av prosjektet har det blitt validert verktøy for å analysere autofagi i T celler. Autofagi er en fysiologisk prosess som regulerer omsetningen av proteiner, organeller og næringsstoffer og kan påvirkes av virusinfeksjoner. Verktøyene skal brukes i videreføring av prosjektet til å analysere hvordan HIV infeksjon påvirker autofagi i primære humane T celler og om autofagi påvirkes forskjellig i undergrupper av T celler. Andre delmål: Bidrag fra prosjektet har resultert i medforfatterskap på to publiserte manuskript i 2014, et manuskript som er akseptert til publikasjon og et andreforfatterskap på et manuskript som er sendt til publikasjon. I tillegg ble det gjennomført avsluttende forsøk til andre delmål av prosjektet. I det ene delmålet har vi undersøkt den regulatoriske T cellenes betydning under mykobakterieinfeksjoner i en musemodell. I det andre delprosjektet kunne vi vise at prinsippet av fotokjemisk internalisering (samarbeid med PCI Biotech, Oslo) kan brukes som hjelpemiddel for å øke CD8+ T celleaktivering av vaksiner in vitro og in vivo. Resultatene skal publiseres i to manuskripter før sluttrapporten for prosjektet leveres.

Årsaken til den økte risikoen for mykobakterieinfeksjoner hos HIV pasienter er fortsatt uklart. I tillegg er det per i dag ingen vaksine på markedet som beskytter effektivt mot tuberkulose hos voksne mennesker. Hovedmålene av prosjektet er å definere mekanismer som bidrar til den økte risikoen for mykobakterieinfeksjoner hos HIV pasienter og utvikling av mer effektive vaksine-strategier mot mykobakterieinfeksjoner.

Forsvar mot mykobakterier krever koordinert samhandling mellom medfødte og spesifikke immunmekanismer, men mye er fortsatt ukjent i forhold til hvordan balansen bør være mellom de ulike mekanismene. Det er kjent at aktivering av spesifikke T hjelperceller spiller en sentral rolle. Pasienter med ubehandlet HIV-infeksjon mister etterhvert T hjelpercellene og blir dermed mer mottagelig for mykobakterielle infeksjoner. I tillegg undertrykker såkalte regulatoriske T celler (T reg) funksjonen av T hjelpercellene.

Aktuelle delmål i dette prosjektet:

Øke kunnskap om forsvarsmekanismer som fører til beskyttende immunitet mot mykobakterier:

Vi har etablert en musemodell for mykobakterielle infeksjoner hvor vi infiserer mus med humanpatogen Mycobacterium avium (M. avium) som har blitt isolert fra en HIV pasient og diskutert som mulig vaksinestamme. Vi har brukt modellen til å karakterisere et mangfold av immunforsvarsmekanismer som bidrar til kontroll av infeksjonen (manuskript publisert i 2013).

Utforske betydning av regulatoriske T celler i mykobakterieinfeksjoner:

Et interessant funn fra musemodellen var en redusert hyppighet av T reg celler i den akutte fasen av infeksjonen, noe som kan bety redusert suppresjon (og dermed økt aktivitet) av T hjelpercellene. Siden lite er kjent om betydningen av T reg cellene i mykobakterielle infeksjoner generelt og ingenting har blitt beskrevet for infeksjoner med M. avium, har vi undersøkt T reg cellenes rolle videre. Vi fant ut at fjerning av T reg cellene under infeksjonen ikke fører til nedgang i bakterietall i infisert vev. Men T reg cellene ble raskere rekonstituert i M. avium infiserte mus etter fjerning. Som mulig mekanisme peker våre resultater på at et høyt systemisk interferon-gamma (IFN-g) nivå under M. avium infeksjonen fører til økt frigjørelse av progenitorceller fra benmargen. Resultatene skal publiseres i resten av prosjektperioden (juli 2014).

Utvikling av mer effektive vaksine-strategier:

En strategi å øke effektiviteten av vaksiner er utvikling av nye hjelpestoffer (adjunvanser) som øker aktivering av CD8+ cytotoksiske T celler i tillegg til CD4+ T hjelpercellene. Vi har derfor testet prinsippet av fotokjemisk internalisering som hjelpemiddel for vaksiner (samarbeid med PCI Biotech, Oslo). Vi fant en økt aktivering av spesifikke CD8+ T celler mot et modellantigen i begge, in vitro og in vitro forsøk. Resultatene skal publiseres i resten av støtteperioden.

T cellefunksjoner i mykobakterielle og HIV infeksjoner:

Vi har etablert protokoller for både isolering, kultivering, biobanking og måling av effektor responsen mot mykobakterier av T cellene. Forskerprosjektet avsluttes i sommer 2014 men får støtte fra HMN i ytterligere 3 år. I den neste finanseringsperioden skal hovedfokuset av prosjektet rettes mot å bruke disse nye metodene til gjennomføring av en klinisk studie med HIV pasientmateriale fra St Olavs hospital og in vitro forsøk med co-infeksjoner av både HIV og mykobakterier i humane celler i de nye BS3 fasilitetene på Kunnskapssenteret.

Forsvar mot mykobakterier krever koordinert samhandling mellom medfødte og spesifikke immunmekanismer, men mye er fortsatt ukjent i forhold til hvordan balansen bør være mellom de ulike mekanismene. Forbedret kunnskap om hva som gir beskyttende immunitet er nødvendig for rasjonell utvikling av nye og effektive vaksiner mot tuberkulose og andre mykobakterieinfeksjoner. Det er kjent er at aktivering av spesifikke T hjelperceller spiller en sentral rolle. Pasienter med ubehandlet HIV-infeksjon mister etterhvert T hjelpercellene og blir dermed mer mottagelig for mykobakterielle infeksjoner. I tillegg undertrykker såkalte regulatoriske T celler (T reg) funksjonen av T hjelpercellene.

Aktuelle delmål i dette prosjektet:

Øke kunnskap om forsvarsmekanismer som fører til beskyttende immunitet mot mykobakterier:

Vi har etablert en musemodell for mykobakterielle infeksjoner hvor vi infiserer mus med humanpatogen Mycobacterium avium (M. avium) isolert fra en HIV pasient. Vi har brukt modellen til å karakterisere et mangfold av immunforsvarsmekanismer som bidrar til kontroll av infeksjonen (manuskript under revisjon).

Utforske betydning av regulatoriske T celler i mykobakterieinfeksjoner:

Et interessant funn fra musemodellen var en redusert hyppighet av T reg celler i den akutte fasen av infeksjonen, noe som kan bety redusert suppresjon (og dermed økt aktivitet) av T hjelpercellene. Siden lite er kjent om betydningen av Treg cellene i mykobakterielle infeksjoner generelt og ingenting har blitt beskrevet for infeksjoner med M. avium, har vi undersøkt T reg cellenes rolle videre. Vi har fjernet T reg cellene i musene før infeksjon med M. avium. Fravær av T reg celler resulterte i noe økt effektorrespons fra T hjelpercellene, men vi klarte ikke å påvise en signifikant nedgang i bakterietall i infisert vev som resultat av dette. På den annen side fant vi at Treg cellene ble raskere rekonstituert i M. avium infiserte mus etter deplesjon. Dette kan muligens skyldes høy systemisk interferon-gamma (IFN-g) nivå under M. avium infeksjon, som kan føre til økt frigjørelse av progenitorceller fra benmargen (manuskript under arbeid).

Utvikling av mer effektive vaksine-strategier:

Vanlige vaksiner aktiverer hovedsakelig CD4+ T hjelperceller og antistoff-produksjon fra B celler. En strategi å øke effektiviteten av vaksiner er utvikling av nye hjelpestoffer (adjunvanser) som øker aktivering av CD8+ cytotoksiske T celler i tillegg til CD4+ T hjelpercellene. Vi har derfor testet prinsippet av fotokjemisk internalisering som hjelpemiddel for vaksiner (samarbeid med PCI Biotech, Oslo). Vi fant en økt aktivering av spesifikke CD8+ T celler mot et modellantigen i begge, in vitro og in vitro forsøk (manuskript under arbeid).

T cellefunksjoner i mykobakterielle og HIV infeksjoner

Av ukjent årsak er HIV-pasienter etter oppstart av antiviral terapi og rekonstituert T hjelpercelletall fortsatt veldig mottagelig for mykobakterieinfeksjoner. Vi undersøker derfor T celleresponsen mot mykobakterier i friske mennesker og pasienter med HIV-infeksjon før og etter oppstart av antiviral terapi. Hovedfokus her er på såkalte multifunksjonelle T hjelperceller som kan lage flere typer effektormolekyler (cytokiner) samtidig. Vi har etablert protokoller for både isolering, biobanking og måling av effektor responsen mot mykobakterier av T cellene. Multicolor-flowcytometry med ti farger brukes til å undersøke forskjellige parameter på hver enkelte celle (prøvetaking ut 2013).

Forsvar mot mykobakterier krever koordinert samhandling mellom medfødte og spesifikke immunmekanismer. Mye er fortsatt ukjent i denne balansen, men aktivering av spesifikke T hjelper celler er antatt å være av spesielt betydning. Pasienter med ubehandlet HIV infeksjon mister i løpet av infeksjonen T hjelper cellene og dermed en viktig forsvarsmekanisme mot mykobakterielle infeksjoner.

Såkalte T regulatoriske (T reg) celler demper T hjelper celler og det spesifikke immunforsvaret og kan dermed også ha en viktig funksjon i langtidsresponsen mot mykobakterielle infeksjoner. Vi har utviklet metoder for å undersøke funksjonen av T reg celler i forskjellige systemer og har, gjennom internasjonalt samarbeid, bidratt til en artikkel om T reg cellenes funksjon i juvenil reumatoid artritt. I prosjektets videre forløp skal vi med lokale samarbeidspartnere undersøke funksjoner av T reg cellene for eksempel i kreftpasienter med multippel myeloma, men prosjektets hovedfokus skal være på T reg cellenes betydning i mykobakterielle infeksjoner.

Vi har etablert og karakterisert en musemodell for mykobakterielle infeksjoner hvor vi infiserer mus med en humanpatogen M. avium bakterie som har blitt isolert fra en HIV pasient (manuskript er sendt til publikasjon). Lite er kjent om betydningen av Treg cellene i mykobakterielle infeksjoner generelt og resultatene i litteraturen er til dels kontroversielle og ingenting har blitt beskrevet for infeksjoner med M. avium. I vår metode bruker vi antistoff for å fjerne T reg cellene i musene før infeksjon med M. avium. Fravær av T reg cellene har resultert i en litt økt interferon gamma (IFN-g) effektor respons fra T hjelper cellene, men vi fant ingen signifikant reduserte bakterietall i infiserte vev. Et interessant funn var at etter T reg deplesjon ble Treg cellene mye raskere rekonstituert i M. avium infiserte mus. Dette kan skyldes økt systemisk IFN-g nivå under M. avium infeksjon, som kan føre til økt frigjørelse av progenitorceller fra benmargen og skal undersøkes videre i prosjektet.

I det andre delprosjektet skal vi undersøke T cellerespons mot mykobakterielle og HIV-relaterte antigener i friske mennesker og pasienter med HIV-infeksjon. En masterstudent på prosjektet jobber med å etablere protokoller for isolering, frysing og ekspandering av humane makrofager og T celler og til høsten vil to nye masterstudenter bli involvert i prosjektet. For tiden bruker vi blodprøver fra friske donorer, men en søknad til Regional Etisk komite (REK) er under arbeid og vi forventer å begynne forsøk med blodprøver fra HIV-pasienter i løpet av de neste månedene.