Molekylære mekanismer ved replikasjonskoblet DNA-reparasjon

I 2009 publiserte vi funnet av en ny PCNA bindingssekvens. Vi fant sekvensen først i AlkB homolog 2 og kalte den derfor AlkB homolog 2 PCNA Interacting motif, APIM. Mer enn 200 proteiner, mange involvert i DNA reparasjon, cellesykluskontroll og epigenetikk, inneholder en sekvens som passer med APIM konsensusen: K/R-F/Y/W-[L/I/V/A]×2-K/R. Trolig er ikke alle disse APIM sekvensene funksjonelle PCNA bindingssekvenser. Vi vil derfor undersøke nærmere hvilke av disse APIM sekvensene som er funksjonelle, og hva som er konsekvensen av å inhibere disse proteinenes binding til PCNA. Vi viste i 2009 at APIM øker effekten av kjemoterapi og har siden den gang jobbet for å bedre kunnskapen om de cellulære og molekulære mekanismene bak denne effekten. Flere av de mer enn 200 proteinene som inneholder APIM sekvesen er involvert i epigenetikk, både i proteiner involvert i modifisering av DNA og histoner. Epigenetisk kontroll av gener er viktig og feil kan føre til sykdommer som for eksempel diabetes, overvekt og ikke minst kreft. Feilaktig epigenetisk kontroll av genuttrykk kan aktivere onkogener og deaktivere tumor supressor gener. Epigenetikk er et relativt nytt fagfelt, og detaljene for hvordan de epigenetiske prosessene styres er på langt nær kjent. Det er velkjent at DNA basen cytosin blir metylert i 5-posisjonen og danner 5-metylcytosin. Dette påvirker uttrykket av genet, og hovedsakelig blir transkripsjon av genet slått av. Hvordan DNA blir demetylert er intill nylig ukjent. Kun i de senere år (2009) har det blitt kjent at proteinene Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase (TET) 1, 2 og 3 trolig er involvert i demetyleringen. TET proteinene oksiderer 5-metylcytosin til 5-hydroxymetylcytosin i en reaksjon som ligner demetyleringen av baseskadene 1-metyladenin og 3-metylcytosin utført av AlkB homolog 2 hvor vi først identifiserte APIM sekvensen. Alle tre TET proteinene har APIM sekvenser. I 2014 har jeg vært stasjonert på Mikrobiologisk institutt i tilknytning til Arne Klungland og Adam Robertsons grupper ved Rikshospitalet i Oslo. Disse har flere publikasjoner på TET proteinene og har konstrukter, antistoffer og etablerte metoder for deteksjon av 5-hydroxymetylcytosin. Jeg har klonet om konstrukter som ineholder det katalytiske domenet til TET1 og 3 til pEYFP plasmider slik at TET proteinene blir fusjonert med en fluorescerende EYFP-tagg. Jeg har konstrukter med EYFP fusjonert på N- og C-terminalen til TET1 og 3, og det ser ut til at TET1 og 3 klonet C-terminalt for EYFP genet er korrekt lokalisert i cellen. Jeg har etablert et nytt assay for å studere protein interaksjon, kalt Fluoresence 2 hybrid assay. I dette assayet har jeg identifisert en interaksjon mellom EYFP-tagget TET1 og 3 og HcRed-tagget PCNA. Jeg jobber nå med å få ferdig APIM mutantene med EYFP-tagg for å se om dette ødelegger interaksjonen. Hvis jeg kan vise at APIM motivet er viktig for bindingen mellom TET proteinene og PCNA vil jeg se på funksjonaliteten til bindingen. Er det forskjell i celler som uttrykker TET wt og celler som uttrykker TET mutert i APIM? Hvilken effekt har APIM peptidet på cellens genuttrykk? Vil man se endringer i nivået av 5-hydroxymetylcytosin? Vil man se endringer i nivået dobbelttrådbrudd? (økt trådbrudd ved overuttrykk av TET2 publisert i 2014, Robertson et al). Vil man se endring i telomerlengden? (økt telomerlengde i Tet trippel knock out celler publisert i 2014 (Lu et al)). Jeg planlegger å lage stabile HeLa celler da disse har lavt uttrykk av endogent TET. Jeg vil også studere effekten av APIM peptid på stamceller, i og med at TET proteinene er veldig aktive i tidlig utvikling. Ved Rikshospitalet finnes et stamcellecenter som kan hjelpe til med drifting av stamcellene. Basert på arbeidet til Marit Otterlei sin forskningsgruppe har selskapet APIM Therapeutics blitt etablert. Selskapet utnytter kroppens naturlige stressmekaniskmer hvorav mange er avhengige av binding til PCNA for opitmal funksjon. Dette gjøres ved å tilsette et syntetisk peptid, kalt ATX-101, som inneholder APIM sekvensen, signal for cellepenetrering og kjernelokalisering. Peptidet binder til PCNA og ser ut til å blokkere PCNA binding av andre APIM-proteiner slik at de hindres i å utføre sine oppgave mest mulig effektivt. I celler som alle rede er veldig stresset, som noen typer kreftceller, er peptidet i seg selv toksisk, mens det i andre celler øker effekten av kjemoterapi. Behandling med ATX-101 har vist økt effekt av Melphalan på multiple myeloma celler, og ATX-101 alene fører til apoptose av multiple myeloma celler, men ikke normale celler (Müller et al., 2013). Gruppen har nylig også publisert at ATX-101 dreper blærekreftceller i kombinasjon med Mitomycin-C, her er det brukt både cellekulturer og realistiske rottemodeller (Gederaas et al., 2014). Blærekreft, mer spesifikt ikke-muskel-invasiv blærekreft, den 5. vanligste kreftformen globalt, er APIM therapautics nåværende satsningsområde. Her blir ATX-101 levert intravesikulært i kombinasjon med Mitomycin-C og selskapet tar sikte på å starte fase I/II kliniske studier i 2015. Bruk av APIM i ikke-muskel-invasiv-blærekreft vil fungere som ”proof of concept”, men ATX-101 viser også lovende resultater for systemisk kreftbehandling. Et eksempel er intravenøs injeksjon av ATX-101 som øker effekten av Cisplatin i muskel-invasiv blærekreft. Utrulig nok skader ikke ATX-101 normale celler ved de dosene som brukes, og foreløpgie tox-studier på hund viser ingen bieffekter av ATX-101. Dersom peptidet fungerer like godt på mennesker som på mus og rotter vil det være en stor fordel for klinikken. Når ATX-101 behandling kombineres med standard kjemoterapibehandling vil pasienter kunne bli behandlet med lavere dose kjemoterapi og få en like god effekt, eller med samme dose kjemoterapi og få en mye bedre effekt. Bruk av ATX-101 i klinikken vil derfor være en stor fordel for pasientene, og fortåelsen av de molekylære mekanismenen som forårsaker den observerte effekten er selve fundamentet for utviklingen av medisinen.