REGIV protein function in Inflammatory Bowel Disease

REG4s funksjon og rolle i inflammatorisk tarmsykdomProsjektet springer ut fra oppdagelsen av at genet som koder for proteinet REG4 er blant de høyest uttrykte i tykktarmen under aktiv inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Samtidig er proteinets funksjon lite kjent. Prosjektet er utformet som en rekke forsøk med mål om å bedre forstå REG4s rolle i inflammatorisk tarmsykdom.Prosjektperioden og finansiering for dette prosjektet er nå over. Vi har likevel et ønske om å fortsette arbeidet med å forstå REG4s funksjon og rolle i IBD, så arbeidet med problemstillingen vil fortsette i den grad tid og finansiering tillater. Utfordringene i dette prosjektet er at vi har manglet en god modell for studie av REG4 sin funksjon. Mus uttrykker et protein som likner på REG4, men reguleringen av dette ser ikke ut til å følge samme mønster som vi kjenner fra mennesker. Dette kan bety at funksjonen til proteinet er en annen i mus enn hos mennesker. Vi har likevel et ønske om å gjennomføre en transkriptomanalyse hvor vi sammenlikner genuttrykk i kolonslimhinne hos mus hvor genet for REG4 er fjernet (REG4 KO mus) med normale mus. Man vil da kunne identifisere hvilke molekylære prosesser som blir endret ved manglende REG4 uttrykk. Slik endring kan være med å opplare hvordan REG4 utøver sin funksjon, og hva denne innebærer. Materiale for å gjennomføre denne analysen er nå samlet inn, men det er en økonomisk utfordring å få gjennomført selve transkriptomanalysen. Vi har derfor for tiden heller valgt å heller fokusere vårt videre arbeid på bruk av humane kolonoider. Dette er en ny metode for ex vivo dyrkning av kolon slimhinne isolert fra pasientmateriale. Man får da gjenskapt et polarisert kolon epitel basert på de individuelle pasientenes biopsier, hvor alle epitelcelletyper er reresentert. Vårt håp er da at vi ved å stimulere disse med rekombinant REG4 protein, gjerne i kombinasjon med inflammatoriske mediatorer, skal kunne identifisere hvilken rolle proteinet har under epitelial inflammasjon. Modellen er fortsatt under etablering, men vil være klar til utstrakt bruk i våre prosjekter i løpet av inneværende år.

REG4s funksjon og rolle i inflammatorisk tarmsykdomProsjektet springer ut fra oppdagelsen av at genet som koder for proteinet REG4 er blant de høyest uttrykte i tykktarmen under aktiv inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Samtidig er proteinets funksjon lite kjent. Prosjektet er utformet som en rekke forsøk med mål om å bedre forstå REG4s rolle i inflammatorisk tarmsykdom.I en større studie av IBD i tykktarmen ble REG4 funnet å være blant de høyest uttrykte genene i tykktarmslimhinnen ved inflammasjon. Videre studier viste at REG4 ble uttrykt i serotoninpositive nevroendokrine celler i normal tykktarm, men at uttrykket spredte seg til flere epitelceller i de øvre lag av slimhinnen under inflammasjon. Tidligere studier antyder at proteinet blir skilt ut av de produserende cellene, og tas opp som bestanddel i det beskyttende slimlaget som dekker den luminale siden av tykktarmen. Dette prosjektet er nå inne i sitt tredje år, og vi nærmer oss slutten av prosjektperioden. I det foregående året har vi videreført arbeidet med å prøve å identifisere en funksjon til proteinet. Dessverre tar arbeid med mus som modell veldig lang til, og vi er enda ikke i mål med de analyser som ble skissert i forrige års rapport. Vi arbeider for tiden mot et mål om å samle opp materiale fra mus hvor REGIV genet er fjernet. Det globale genuttrykket i dette materialet skal så sammenlignes med materiale fra mus som fortsatt uttrykker REGIV normalt. Ved å gjøre en slik sammenligning på tvers av alle gener håper man å identifisere gener hvis uttrykk korrelerer med REGIV tilgjengelighet. Disse kan da være med å antyde en mulig funksjon for REGIV, samt undersøkes videre som potensielle bindingspartnere. Vi har i dette prosjektet vurdert REGIV som en potensiell diagnostisk markør for inflammatorisk tarmsydom. I de innledende forsøkene målte vi nivå av REGIV i avføring fra IBD-pasienter og personer uten IBD. Disse undersøkelsene antyder at det også er andre inflammatoriske tilstander i mage-tarm kanalen som påvirker nivået av REGIV i avføring, noe som gjør REGIV nivå til en uegnet markør for IBD. Vi håper likevel å få muligheten til å jobbe videre med måling av REGIV i avføring for å kunne forstå bedre hvilke tilstander som bidrar til de økte nivåene. I løpet av det siste året har det ved vår lab blitt arbeidet mye med å etablere en ny laboratoriemodell for kolonslimhinne. Denne metoden muliggjør å dyrke slimhinnelaget isolert fra humant materiale, og å utføre stimuleringsforsøk på disse. Fordelen med disse "kolonoidene" sammenlignet med tradisjonelle cellekulturer, er at man her har alle epitelcelletyper representert samtidig i prøven. Man arbeider også med reelle pasientprøver, og ikke med udødeliggjorte kreftcellelinjer som eller er vanlig. Denne modellen kan derfor representere et mye bedre utgangspunkt for vårt arbeid med å identifisere REGIV's funksjon. Arbeid med en slik modell løser også vår utfordring med at mus ikke ser ut til å regulere uttrykket av REGIV på samme måte som mennesker. Arbeidet med å finne REGIV interaksjonspartnere ved hjelp av immunoprecipitering og massespektrometri har til nå ikke ført frem til identifikasjon av sannsynlige interaksjonspartnere. Vi håper likevel å få muligheten til å arbeide videre med dette i tiden som kommer.

REG4 funksjon og rolle i inflammatorisk tarmsykdomProsjektet springer ut fra oppdagelsen av at genet som koder for REG4 protein er blant de høyest uttrykte i tykktarm under aktiv inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Samtidig er proteinets funksjon lite kjent. Prosjektet er utformet som en rekke forsøk med mål om å bedre forstå REG4 sin rolle i inflammatorisk tarmsykdom.I en større studie av IBD i tykktarm ble REG4 funnet å være blant de høyest uttrykte genene i tykktarmslimhinne ved inflammasjon. Videre studier viste at REG4 ble uttrykt i serotonin positive nevroendokrine celler i normal tykktarm, men at uttrykket spredte seg til flere epitelceller i de øvre lag av slimhinnen under inflammasjon. Man tror også at proteinet blir skilt ut, og tas opp som bestanddel i det beskyttende slimlaget som dekker den luminale siden av tykktarmen. Samtidig som dette proteinet lages i store mengder i tykktarmen ved sykdom, vet man veldig lite om dets funksjon. Et nært beslektet protein (REG3G) er blitt vist å ha antimikrobiell funksjon. Andre studier har vist at REG4 kan stimulere celledeling. Vårt prosjekt er utformet med mål om å avdekke REG4s funksjon i tykktarmen, samt å forstå hvilken rolle dette spiller ved betennelsestilstander i tarmen som f.eks. IBD. Vi har i vårt prosjekt ønsket å bruke mus som modellorganisme for å kunne si noe om REG4 funksjon, og har derfor i den siste tiden karakterisert REG4 uttrykk i mus for å kunne vurdere om REG4 har samme uttrykksmønster i mus som i mennesker. Dette er en viktig forutsetning for at man kan trekke gode slutninger fra dyreforsøk. Dette arbeidet har munnet ut i en hovedoppgave ved medisinsk fakultet, NTNU, og vi arbeider for tiden videre med å publisere resultatene i et fagtidsskrift. Vårt arbeid med REG4 i mus viser at det er visse forskjeller i uttrykks-mønster av dette proteinet i mus og mennesker, bl.a. at basaluttrykket er høyere i mus. Likevel kan det være slik at funksjonen er den samme. Vi har derfor videreført vårt arbeid med REG4 KO mus, og har isolert prøver som skal analyseres på genekspresjonsnivå. Målet med denne analysen er å sammenlikne gen-uttrykk i tarm fra villtype mus med REG4 KO mus, og dermed kunne vurdere hvilken effekt tapet av dette proteinet har på tarmfunksjon i mus. Vårt håp er at disse analysene skal kunne føre oss nærmere et svar på hvilken funksjon REG4 har i human tykktarm. Videre er vi også, i samarbeid med en rekke andre forskere ved NTNU, i ferd med å gjennomføre et celleforsøk med kolon epitlecellekulturer. Her stimulerer vi med en rekke pro-inflammatoriske cytokiner over en lengre tidsperiode, og tar ut prøver til genekspresjonsanalyse underveis. At REG4 uttrykk øker ved inflammasjon i tarm er allerede blitt vist. Men det er fortsatt ikke klart hvilke inflammatoriske mekanismer som stimulerer til den økte produksjonen, noe vi håper at denne serien med forsøk kan bidra til å klargjøre. Vi vil også kjøre et parallelt forsøk hvor vi stimulerer med REG4, og håper at dette forsøket på sin side kan vise hvilken effekt REG4 har på epitelcellene. Når det gjelder REG4 funksjon ved inflammasjon, er det fra tidligere forsøk klart at REG4 uttrykkes i store mengder av epitelceller i den betente humane tykktarm. Det faktum at dette proteinet dannes og skilles ut i store mengder, antyder at det har en funksjon utenfor cellens indre. Dette kan være som signalsubstans til omkringliggende celler, eller som antimikrobielt peptid. Uansett er det sannsynlig at proteinet må interagere med andre proteiner for å utøve dets funksjon. Vi jobber derfor med å benytte immunoprecipitasjon for å fange opp REG4 og eventuelle bindingspartnere fra humane tykktarmsbiopsier. Proteinkomplekser som blir fanget opp kan videre karakteriseres med massespekrometri, og man kan identifisere poteinsielle bindingspartnere til REG4.

REG4 funksjon og rolle i inflammatorisk tarmsykdomProsjektet springer ut fra oppdagelsen av at genet som koder for REG4 protein er blant de høyest uttrykte i tykktarm under aktiv inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Samtidig er proteinets funksjon lite kjent. Prosjektet er utformet som en rekke forsøk med mål om å bedre forstå REG4 sin rolle i inflammatorisk tarmsykdom.I en større studie av IBD i tykktarm ble REG4 funnet å være blant de høyest uttrykte genene i tykktarmslimhinne ved inflammasjon. Videre studier viste at REG4 ble uttrykt i serotonin positive nevroendokrine celler i normal tykktarm, men at uttrykket spredte seg til flere epitelceller i de øvre lag av slimhinnen under inflammasjon. Man tror også at proteinet blir skilt ut, og tas opp som bestanddel i det beskyttende slimlaget som dekker den luminale siden av tykktarmen. Samtidig som dette proteinet lages i store mengder i tykktarmen ved sykdom, vet man veldig lite om dets funksjon. Et nært beslektet protein (REG3G) er blitt vist å ha antimikrobiell funksjon. Andre studier har vist at REG4 kan stimulere celledeling. Vårt prosjekt er utformet med mål om å avdekke REG4s funksjon i tykktarmen, samt å forstå hvilken rolle dette spiller ved betennelsestilstander i tarmen som f.eks. IBD. Vi ønsker å benytte oss av en rekke ulike metoder for å nå målet om bedre forståelse av REG4 funksjon, og har brukt det foregående år på å etablere disse metodene. REG4 knockout mus er blitt anskaffet, og de første innledende forsøk med disse er gjennomført. Målet vårt her er å se hvordan disse dyrenes manglende evne til å lage REG4 påvirker tykktarmens funksjon både ved god helse og ved inflammasjon. Vi har videre evaluert cellelinjer for bruk i studier av REG4. I denne sammenheng har vi evaluert ulike cellelinjers evne til å uttrykke REG4, og så gjennomført stimuleringsforsøk med disse for å kunne se om vi kan indusere økt REG4-produksjon som respons på eksternt stimuli. Vi arbeider også med å etablere en såkalt ex vivo modell for tykktarmslimhinne. Målet med disse modellene er å kunne gjenskape våre funn i cellelinjer i en mer pasientnær modell, hvor vi da bruker slimhinnepreparater fra friske personer og IBD-pasienter for å studere REG4-utskillelse som respons på stimuli. I den kommende tiden vil vi fortsette etableringen av disse metodene, og vi håper at de vil gjøre oss i stand til å finne relevant kunnskap om hvilken rolle REG4 har ved IBD, både patofysiologisk og klinisk.