Fra cystoskopi til urinprøve: Exosomer i urin som diagnostisk markør for blærekreftpasienter

Identification of urinary and serum molecular markers for bladder cancer within extracellular vesiclesDette projekt har etableret ekspertise om 'EV'er' og 'flydende biopsi' på IKOM / DMF / St.Olavs Hospital. Standardmetoden til BC-biomarkørsøgning er baseret på fast biopsi. Vores tilgang til at sammenligne exosomal mikroRNA-ekspression før og efter transuretral resektion af blæretumor (TURBT) er efter vores bedste overbevisning ikke blevet udført tidliger.Vi har det siste året fått svært spennende resultater hva gjelder å identifisere tRNA-deriverte fragmenter (tRFs)s om potensielle blærekreftmarkører. Dette er nybrottsarbeid som krever betydelig bioinformatisk kompetanse. I alt har vi analysert uttrykket av tRFs i extracellulære vesikler i urin og serum, samt serum supernatant fra 41 pasienter med ikke-muskalinvasiv blærekreft og 15 ikke-kreft med benigne urologiske lidelser. Alt materiale stammer fra VESCAN-biobanken, hvor det siden 2017 har vært lagret serum og urin fra pasienter som gjennomgår blærekreftkirurgi ved St.Olavs hospital. De mest spennende resultater hva gjelder tRFs finner vi i ekstracellulære vesikler fra urin og fra serum supernatant. Vårt arbeid har vært todelt, på den måte at vi har gjennomført en primær RNA- isolering og sekvensering. Deretter har vi gjennomført en ny RNA-isolering og sekvensering fra en ny alikvot fra samme pasientprøve. I den primære sekvenseringen ble det funnet over 100 tRFs i urin, og ca. 20 tRFs i serum supernatant som var differensielt uttrykt mellom blærekreftpasienter og ikke-kreft pasienter. Ved isolering og sekvensering av ny prøvealikvot, var det 14 tRFs i urin og 6 tRFs i serum supernatant som fortsatt var differensielt uttrykt. Dette viser hvor viktig det er med resiolering og resekvensering for å oppnå reliabilitet av resultatene. Når man ser på de enkelte tRFs er det særlig ett fragment, tRF-16-«konfidensielt», som kan vise seg å være en lovende markør for blærekreft. Dette fragment er kraftig nedregulert i blærekreftpasienter sammenliknet med ikke-kreft pasienter. Videre arbeid med dette og flere andre potensielt viktige tRFs vil munne ut i et manuskript som per dags dato er under utforming.

tRNA profile in urinary exosomes isolated from Urothelial Cancer patients before and after TUR-bUrinary exosome-based diagnostics in the clinical setting could potentially replace cystoscopy for initial diagnosis of bladder cancer, monitoring for recurrence as well as progression and therefore could accelerate treatment and prevent progression of BC patients. Better understanding of urinary EVs may lead to novel targeted therapies for BC.We have established a biobank which according to our knowledge is the only one in the world where bladder cancer samples are collected both pre- and postoperatively with the specific goal of enabling EV analysis. More than 70 patients, 200 patient samples and 2000 individual aliquots are currently stored in the VESCAN biobank. This provides ample opportunities for biomarker discovery for our own research group, as well as other research groups that apply for use of the biobank material. In our first publication next-generation sequencing (NGS) was performed for EV-contained miRNAs isolated from urine and serum of 41 patients with non-muscle invasive BC (NMIBC) and 15 non-cancer patients (NCPs) with benign cystoscopy findings. We identified two potential EV containing miRNAs as potential BC-specific biomarkers; miR-451a and miR-486-5p, that were significantly upregulated pre-surgery compared to post-surgery check-up where no recurrence was detected. We are currently looking for EV containing tRNAs as potential biomarkers. The bioinformatics and article is expected to be complete in 2022.

Fra cystoskopi til urinprøve: Exosomer i urin som diagnostisk markør for blærekreftpasienterÅret har vært preget av et stort sekvenseringseksperiment utført ved Genomics Core Facility (GCF), som har vært en oppfølger til et omfattende prosjekt gjennomført i 2019. Eksperimentet har basert seg på materiale fra VESCAN-biobanken, en blærekreftbiobank som er opprettet i et samarbeid mellom Urologisk avdeling, St.Olavs hospital og Biobank1.VESCAN biobanken inneholder urin- og serumprøver som er tatt før blærekreftkirurgi (transurethral reseksjon av blæretumør) og deretter ved postoperative kontroller det første året. I 2019 utførte vi et sekvenseringseksperiment hvor korte RNA (mikroRNA og andre korte RNA som tRNA og yRNA) i exosomer fra blod og urin hos 28 blærekreftpasienter og 15 kreftfrie kontroller ble sekvensert. Exosomer er nanovesikler som inneholder en rekke biologiske komponenter, som blant annet kan undersøkes i diagnostisk henseende. Hver av de 28 pasientene har levert urin- og blodprøver både før blærekreftkirurgi og ved multiple postoperative kontroller som så har blitt sentrifugert for senere exosomanalyse og lagret i Biobank1. I 2020 har vi utvidet pasienttallet for denne studien til 41. Exosomale korte RNA fra urin og serum er sekvensert fra prøver tatt både før og etter blærekreftkirurgi for disse pasientene. Med dette pasientgrunnlaget er studien blitt lang mer robust og vi har fått inkludert flere pasienter fra de ulike sykdomsstadier. I tillegg til å øke pasienttallet har vi sekvensert replika prøver for 10 av de 28 pasientene fra første sekvenseringsrunde. Til dette har vi benyttet nye alikvoter fra eksakt samme prøve fra VESCAN biobanken som ved første sekvenseringsrunde. Dette er en vesentlig kvalitetskontroll som gjør at resultatene er verifiserbare. Tradisjonelt har man benyttet PCR som verifisering av sekvenseringsresultater, men etter diskusjoner med bioinformatiker Arnar Flatberg ved GCF valgte vi re-sekvensering som verifiseringsmetode da dette gir like god kvalititetskontroll, og innebærer mindre manuelt arbeide som øker sjansen for menneskelige laboratoriefeil. Det var Biobank 1 som utførte isolering av exosomer og korte RNA, og GCF som stod for selve sekvenseringen. Flatberg har deretter gjennomført de bioinformatiske analyser, som har identifisert to spennende mikroRNA i urin exosomer, som potensielle biomarkører. Disse omtales nærmere i manuskriptet “Differentially expressed extracellular microRNAs before and after transurethral resection of bladder tumor”, som vil bli innsendt til anerkjent internasjonalt tidsskrift snarlig. I tillegg til det ovennevnte har vi utvidet de bioinformatiske analyser ved å videreutviklet et samarbeid med bioinformatiker Endre Anderssen ved Universitet i Tromsø. Anderssen har analysert en type kort RNA kalt t-RNA-deriverte fragmenter (tRF) i exosomer. Disse tRFer har vist seg å kunne spille en viktig rolle i kreftutvikling, og har også potensiale som biomarkør. Dette arbeidet skal sammenfattes i en vitenskapelig artikkel, som vil være sin første av sitt slag, da dette temaet tidligere ikke er utforsket i blærekreftsammenheng. Formålet med VESCAN biobanken er å undersøke potensialet til ulike diagnostiske markører for blærekreftpasienter med det formål å erstatte cystoskopi, en invasiv og plagsom undersøkelse av urinblæren, med enkle urin og/eller blodprøver. Blærekreft er den dyreste kreftform for helsevesenet pga. de mange cystoskopi undersøkelser utført som kontroll av disse pasienter.