eRapport

Fosfoprotein-proteomikk for identifikasjon av nye behandlingsmål. Flt3 reseptor-tyrosinkinase som modell for feilregulert proteinfosforylering i akutt myelogen leukemi

Prosjekt
Prosjektnummer
911006
Ansvarlig person
Kari Espolin Fladmark
Institusjon
Universitetet i Bergen
Prosjektkategori
Forskningsprosjekt
Helsekategori
Oncogenesis & Cancer Research
Forskningsaktivitet
Grunnforskning
Rapporter
2007
Flt3 transmembran reseptor-tyrosinkinase benyttes som modell for feilregulert proteinfosforylering i blodkrefttypen akutt myelogen leukemi (AML). Hele 30% av pasientene har mutasjoner i Flt3 som er forbundet med dårlig prognose.Prosjektet vil bli avsluttet våren 2008 med ferdigstillelse av følgende arbeider: 1) Oveland, Gjertsen, Wergeland, Selheim, Fladmark, Hovland “Ligand-induced Flt3-downregulation modulate chemosensitivity in THP-1 acute myeloid leukemia cells”. 2) Oveland, Hovland, Wergeland, Gjertsen, Lorens, Fladmark “High-level expression of Flt3 induces cell death”. 3) Wergeland, Oveland, Sjøholt, Bedringaas, Hovland, Bruserud and Gjertsen “Flt3 mutations proximate to its ubiquitin dependent endocytosis motif suspend Hdm2 modulation” 4) Differential phospho-protein pattern of proteins interacting with mutant Flt3 receptor tyrosine kinase. Hodneland, Oveland, Frøyset, Selheim, Gjertsen, Fladmark and Hovland. Arbeid 1-3 vil inngå i Ovelands PhD grad som leveres 1. juli. Alt praktisk laboratoriearbeid er avsluttet mht disse og manuskripter skrives nå sammen. Prosjektet skulle i utgangspunktet omhandle identifikasjon av Flt3-signaleringsveier i leukemicellelinjer stabilt transfektert med ulike mutanter av Flt3 som hyppig forekommer i leukemi. Det viste seg at det ikke var mulig å uttykke disse ulike mutantene i cellelinjer da ekpresjonen induserte apoptotisk celledød. Man ble tvunget til å endre problemstillingen. At overuttrykk av Flt3 gir celledød er i selv interessant og dette ble studert videre (arbeid #2). Kvantitativ proteomikk (SILAC) ble så etablert og tatt i bruk for å studere differensielt proteinuttrykk både i de apoptotiske cellene og i celler stimulert over lang tid med Flt3-ligand (arbeid #1 og #2). Noen av de tidlige konstruerte mutantene har blitt brukt i arbeid #3. Vi har også utviklet en metode for å studere forskjeller i bindingsinteraksjoner med Flt3 reseptoren og har ved hjelp av denne studert hvorvidt ulike mutasjoner vil påvirke interaksjonene med reseptoren (arbeid #4).
2006
Flt3 transmembran reseptor-tyrosinkinase benyttes som modell for feilregulert proteinfosforylering i blodkrefttypen akutt myelogen leukemi (AML). Hele 30% av pasientene har mutasjoner i Flt3 som er forbundet med dårlig prognose.Mutasjoner i Flt3 er enten lengdemutasjoner (ITD) i det intracellulære området rett under cellemembranen, eller mutasjoner i kinasesetet. Mutasjonene fører til at kinasen blir hyperaktiv, dvs uavhengig av Flt3-ligand for å stimuleres. Hos pasienter ved Haukeland Universitetssykehus finner vi en stor variasjon i både lengden og sekvensområdet til Flt3-ITD. For å undersøke hvorvidt de ulike ITD mutasjonene gir forskjeller i cellesignalisering, har vi kjørt prøver fra pasienter på RNA ekspresjonsmatriser. Vi finner flere interessante endringer i signalveiene på RNA-nivå som har vist seg å korrelere til proteinstudier. Vi ønsker å benytte proteinanalysemetoder (proteomikk) til å finne feilregulerte proteiner da fremtidens målrettede behandling går ut på å hemme spesifikke signalveier. Aktiverer celler med mutert Flt3 andre signalveier enn celler med normal Flt3? Normal Flt3 og Flt3-konstrukter basert på mutasjonene i pasientmaterialet gir høy ekspresjonseffektivitet når uttrykt fra ekspresjonsvektoren. Ved transfeksjon med normal Flt3 av ulike adherente cellelinjer, viser det seg at cellene begynner å miste taket og dø. Dette er overraskende da Flt3 i følge litteraturen fremmer overlevelse, men aktuell forskning viser også at kreftfremkallende proteiner (onkoproteiner) i enkelte situasjoner kan fremkalle celledød (apoptose). Ved bruk av etablerte metoder har vi likevel ikke klart å påvise apoptose. Vi vil derfor gjøre proteomikk på de transfekterte cellene i tidsrommet før de dør av Flt3 uttrykket. Proteiner som binder til reseptorer etter ligandstimulering binder ofte til fosforylerte aminosyrer og ofte i det tilsvarende området som ITDene er lokalisert. Aktuelle aminosyrer i dette området har blitt ”slått ut”. Vi detekterer forskjellige proteinfosforyleringsmønstere mellom de ulike mutantene og en interessant observasjon er at ett av de mutante proteinene fører til ytterligere økt celledød. Vi benytter SILAC (stable isotope labeling with amino acids in cell culture) til å identifisere Flt3 bindingspartnere og nedstrøms signalproteiner. SILAC er en kvantitativ proteomikkmetode som muliggjør sammenligning av proteinekspressjon/ fosforylering mellom opptil 3 ulike cellekondisjoner vha isotopermerking og peptidanalyse med LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry). Mekanismen for Flt3 reseptorinternalisering kan fortelle noe om rollen til Flt3 i AML. Vi har utført et SILAC-forsøk hvor en cellelinje som uttrykker normal Flt3 ble langtids-stimulert med Flt3-ligand, noe som medfører nedregulering av reseptoren. Vi har identifisert omtrent 700 SILAC-proteiner vha LC-MS. Ulike bioinformatikkverktøy ble benyttet for å behandle de store datamengdene, og det viste seg at kun et fåtall av de identifiserte proteinene var opp/ned-regulerte etter langtids-stimuleringen. Disse verifiseres nå ved hjelp av Western blot. SILAC benyttes nå til å undersøke proteiner som er feilregulerte som et resultat av ulike mutasjoner i Flt3. For å benytte SILAC spesifikt til fosfopeptider, tar vi i bruk bestemte fosfopeptidanrikende kolonner og 2 dimensjonell kapilær LC–MS. Det er nå utviklet gode metoder for LC basert proteinfraksjonering på PROBE som vil gjøre det lettere å finne identiteten på fosfoproteiner i en kompleks proteinblanding.
2005
30% av akutt myelogen leukemi pasienter har mutasjon i tyrosinkinase-reseptoren Flt3. Det arbeides med å kartlegge hvilken betydning disse mutasjonene har for funksjonen av Flt3. Vha massespektrometri identifiseres endringer i Flt3 og bindingspartnere av Flt3. De cellulære signalveiene som settes i gang av Flt3 blir kartlagt.Flt3 er en transmembran tyrosinkinase-reseptor som er mutert i 30 % av pasienter med akutt myelogen leukemi (AML). Mutasjonene er forbundet med dårlig prognose. Mutasjonene finnes som en intern tandem duplikasjon (ITD) i området rett under cellemembranen, eller som punktmutasjon/delesjon i det aktive setet. Mutasjonene fører til at kinasen har ligand-uavhengig aktivitet. Ved hjelp av etablert diagnostikk ved HUS, har vi analysert over 200 pasienter for mutasjoner i Flt3 på gennivå, og funnet 58 pasienter med ITD og 13 med aktivt setemutasjon. Deteksjon av mutasjon i et gen gir ikke noen direkte informasjon om hvorvidt mutasjonen endrer proteinets opprinnelige funksjon og dermed også signaliseringen i cellen. Ved ITD finner vi en stor variasjon i lengden på duplikasjonen og sekvensområdet som dupliseres. For å undersøke hvorvidt denne heterogeniteten blant mutasjonene gir forskjeller i cellenes molekylære signalveier, har vi kjørt 48 prøver fra disse pasientene på RNA ekspresjons matiser og holder for tiden på å bearbeide disse dataene. I fremtidens målrettede behandling ønsker man å hemme spesifikke signalveier i cellene. Signalveiene som aktiveres av mutert Flt3 er ikke kjent og vi ønsker å bruke proteinanalyse (proteomikk) for å kartlegge disse. Som modellsystem har vi laget ulike konstrukter basert på mutasjonene vi har funnet i pasientmaterialet og klonet disse inn i retroviral vektor. Ved transfeksjon av ulike cellelinjer med normal Flt3 viser det seg at cellene dør. Dette funnet er overraskende da Flt3 i følge litteraturen hindrer celledød og fremmer overlevelse. Mekanismen og årsaken til dette fenomenet blir nå undersøkt. Dette har komplisert opprettelse av stabile cellelinjer og vi har nå tatt i bruk en vektor hvor vi kan regulere Flt3 ekspresjonen. Vi arbeider med å kartlegge signalveier indusert av ligand og mutert Flt3 ved å identifisere fosforyleringssetene i Flt3 reseptoren og samtidig hvilke proteiner som binder til reseptoren. Vi har optimalisert metoder for å kunne fiske ut store mengder av både Flt3 reseptor og bindingspartnerne. Vi har identifisert ligandavhengige bindingspartnere av Flt3. Ved hjelp av mutasjonsstudier arbeider vi nå med å kartlegge bindingsområdet til disse Flt3 partnerne. Vi forsøker også å kartlegge signalveiene nedstrøms. Immunopresipitering av tyrosinfosforylerte proteiner er benyttet og prøver fra disse forsøkene kjøres nå på LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry). Videre har vi benyttet kommersiell rekombinant normal/mutert Flt3 til å fosforylere lysat fra leukemicellelinjer. Fra disse forsøkene har vi plukket ut fosfoproteinene som har opp/nedregulert fosforyleringsnivå og holder på med å identifisere disse ved hjelp av MALDI-TOF massespektrometri. En annen metode vi holder på å etablere er SILAC. Med denne metoden kan vi kvantitativt sammenligne proteinekspresjon mellom 2-3 ulike cellekondisjoner ved hjelp av isotopemerking og peptidanalyse. For å benytte SILAC spesifikt til fosfopeptider, tar vi i bruk bestemte fosfopeptidanrikende kolonner og LC –QTOF massespektrometri. Flowcytometri med antistoffer mot fosforylerte proteiner er også brukt til å studere fosforyleringsmønsteret i celler fra AML pasienter. Ved å stimulere cellene med ulike cytokiner har vi kunnet dele inn pasientens signalprofil i grupper etter fosforyleringsnivået i ustimulerte og stimulerte celler. Disse signalprofilene korrelerte med genetiske endringer som Flt3 mutasjon og sykdomsutfall.
2004
Prosjektet tar i bruk funksjonell genomikk som et verktøy innen diagnostikk, med pasientbehandling for øye. Vi ønsker å benytte proteinbasert metodikk (proteomikk) til å identifisere signalproteiner som er modifisert ved kreftsykdom.Flt3 er en tyrosinkinase-reseptor som er mutert i 30 % av pasienter med akutte myelogen leukemi. Mutasjonene er forbundet med dårlig prognose. De finnes i 1) det intracellulære området rett under cellemembranen som en intern tandem duplikasjon (ITD) eller 2) i det aktive setet som en punktmutasjon eller delesjon. Mutasjonene fører til at kinasen blir hyperaktiv. Vi har på gennivå analysert ca 170 pasienter for mutasjoner i Flt3 (etablert diagnostikk ved Haukeland Universitetssykehus). Vi har funnet 51 pasienter med ITD og 12 med aktivt setemutasjon. Ved ITD finner vi en stor variasjon i lengden på duplikasjonen og sekvensområdet som dupliseres. Deteksjon av mutasjon i et gen gir ikke noen direkte informasjon om hvorvidt mutasjonen endrer proteinets opprinnelige funksjon og dermed også signaliseringen i cellen. Vi ønsker derfor å undersøke om proteinanalyser (proteomikk) kan benyttes til å finne feilregulerte proteiner. Flt3-ligand (FL) stimulerer vekst av celler både med og uten Flt3-mutasjon. Kan det være at FL og mutert Flt3 ikke aktiverer de samme signalveiene? For å studere dette konstruerer vi nå et modellsystem basert på mutasjonene vi har funnet i pasientmaterialet. Konstruktene har blitt klonet inn i en retroviral ekspressjonsvektor og transfektert stabilt inn i leukemicellelinjer ved bruk av virusinfeksjon. Vi arbeider nå med å kartlegge FL- og mutasjonsinduserte signalveier ved å identifisere fosforyleringssetene i Flt3 reseptoren og samtidig de proteinene som binder til reseptoren. Dette gjøres vha massespektrometri. Vi har optimalisert metoder for å kunne fiske ut store mengder av både Flt3 reseptor og bindingspartnerne. Ved hjelp av antistoff mot spesifikke proteiner og Westernblott har vi vist at noen proteiner binder til reseptoren kun når den er ligandstimulert. Derimot er det enkelte av disse proteinene som ikke binder til mutert reseptor. Basert på kunnskap fra reseptorer som er i samme familie er det stor sannsynlighet at disse binder i juxtamembranområdet hvor ITDene er lokalisert. Proteiner som binder til reseptorer etter ligandstimulering binder ofte til fosforylerte aminosyrer. For å vise dette mutere vi nå de aktuelle aminosyrene i dette området. Man trenger store mengder protein for å identifisere fosforyleringsseter. Under optimaliseringsprosessen for rensing av Flt3 reseptoren har vi benyttet kommersiell rekombinant Flt3 til å skreddersy MS-metodene for påvisning av fosforyleringsseter. Vi har til dags dato funnet to peptider som ser ut til å være fosforylert. Vi ønsker også å kartlegge signalveiene nedstrøms for reseptorene. Immunopresipitering av tyrosinfosforylerte proteiner benyttet også her og prøver fra disse forsøkene kjøres nå på LC-MS. Vi har også benyttet oss av flowcytometri med antistoffer mot fosforylerte proteiner til å studere fosforyleringsmønster i celler fra AML pasienter. Vi fant at ved å stimulere cellene med ulike cytokiner som finnes naturlig i beinmargen kunne vi dele inn pasientens signalprofil i grupper etter hvor høyt fosforyleringsnivået var i ustimulerte og stimulerte celler. Disse spesifikke signalprofilene korrelerte med genetiske endringer som Flt3 mutasjon og sykdomsutfall.
2003
Prosjektet tar i bruk funksjonell genomikk (FUGE) som et verktøy innen diagnostikk, med pasientbehandling for øye. Vi ønsker å benytte proteinbaserte metodikk (proteomikk) til å identifisere signalproteiner som er modifisert ved kreftsykdom.Flt3 er en tyrosin kinase reseptor (Flt3) som er mutert i 30 % av alle akutte myelogene leukemier. Mutasjonene er forbundet med dårlig prognose. Mutasjonene finnes i 1) det intracellulære området rett under cellemembranen som en intern tandem duplikasjon (ITD) eller 2) i det aktive setet som en punktmutasjon eller delesjon. Mutasjonene fører til at kinasen blir hyperaktiv. Vi har på gen nivå analysert ca 150 pasienter for mutasjoner i Flt3 (etablert diagnostikk ved Senter for Medisinsk Genetikk og Molekylær Medisin (SMGM), oktober 2003). Vi har studert den funksjonelle effekten av disse mutasjonene ved å stimulere leukemiceller med og uten mutasjon i Flt3 kinasen med Flt3 ligand (FL). Vi fant at FL stimulerer vekst i begge tilfellene (Bruserud 2003). Studier av den angiogenetiske fenotype viste at aktivt setemutasjon gav økt utskillelse av IL12 (Glenjen 2003). Vi har funnet 48 pasienter med ITD og 10 med aktivt setemutasjon. Ved ITD finner vi en stor heterogenitet i lengden på duplikasjonen og sekvensområdet som dupliseres. Vi arbeider nå med en bioinformatisk motivanalyse for å se om pasientene kan subgrupperes og hvorvidt dette korrelerer med kliniske parametere (Hovland et al, manuskript). Deteksjon av mutasjon i et gen gir ikke noen direkte informasjon om hvorvidt mutasjonen endrer proteinets funksjon. Vi ønsker derfor å undersøke om proteinanalyser (proteomikk) kan benyttes til å finne feilregulerte proteiner. FL stimulerer vekst av celler både med og uten Flt3-mutasjon. Kan det være at FL og mutert Flt3 ikke aktiverer de samme signalveiene? For å studere dette holder vi på å konstruere et modellsystem basert på mutasjonene vi har funnet i pasientmaterialet. Vha seterettet mutagenese er det er laget to konstrukter for ITD (Hovland, 2002) og to for aktivt setemutasjon. Konstrukter hvor kinase aktiviteten er ødelagt og hvor et potensielt ubiquineringsmotiv er påvirket er også laget. Disse er nå klare til å transfekteres inn i leukemicellelinjer vha LentiViral transfeksjon. For å kartlegge FL- og mutasjonsinduserte signalveier vil vi identifisere fosforyleringssetene i Flt3 reseptoren samt de tyrosin-fosforylerte substratene til Flt3 vha massespektrometri (MS). Vi arbeider nå med optimalisering av immunopresipiteringsmetoder for å kunne fiske ut både substrater og Flt3 reseptor til MS-analyse. Mange av de genetiske endringene som vi finner ved leukemi finnes også i leukemi-celle linjer, inkludert Flt3-mutasjoner. Vi har funnet forskjeller i fosfo-protein mønster for ulike cellelinjer etter stimulering med FL. Disse forskjellene vil nå bli forsøkt identifisert vha MS. Vi har vist at ITD gir pasientceller et eget fosforylerings mønster (Irish et al, innsendt). Fosforyleringsmønster i celler fra 30 pasienter ble benyttet til å klassifisere patogenetiske forskjeller mellom de ulike leukemiene. Etter FL-stimulering ubiquitineres Flt3, internaliseres og brytes så ned. Vi har funnet en resiprok regulering av Flt3 og ubiquinasen Hdm2 som sannsynliggjør at Flt3 fosforylerer Hdm2 som igjen ubiquinerer Flt3 (Wergeland et al, manuskript). ITD ser ut til å gi økt ubiquinering. Dersom vi med vårt modell system kan gjøre en proteomikk-basert mutasjonsanalyse vil vi videre se hvorvidt proteomikk kan benyttes for å identifisere andre feilregulerte signalveier.
Vitenskapelige artikler
Wergeland L, Sjøholt G, Haaland I, Hovland R, Bruserud Ø, Gjertsen BT

Pre-apoptotic response to therapeutic DNA damage involves protein modulation of Mcl-1, Hdm2 and Flt3 in acute myeloid leukemia cells.

Mol Cancer 2007;6():33. Epub 2007 mai 11

PMID: 17498302

Irish JM, Anensen N, Hovland R, Skavland J, Børresen-Dale AL, Bruserud O, Nolan GP, Gjertsen BT

Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression are detected in acute myeloid leukemia cells with high levels of phosphorylated wild-type p53.

Blood 2007 Mar;109(6):2589-96. Epub 2006 nov 14

PMID: 17105820

Oveland E, Fladmark KE, Wergeland L, Gjertsen BT, Hovland R

Proteomics approaches to elucidate oncogenic tyrosine kinase signaling in myeloid malignancies.

Curr Pharm Biotechnol 2006 Jun;7(3):185-98.

PMID: 16789903

Solstad T, Fladmark KE

Algal toxins as guidance to identify phosphoproteins with key roles in apoptotic cell death.

Curr Pharm Biotechnol 2006 Jun;7(3):209-15.

PMID: 16789905

Irish JM, Hovland R, Krutzik PO, Perez OD, Bruserud Ø, Gjertsen BT, Nolan GP

Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells.

Cell 2004 Jul;118(2):217-28.

PMID: 15260991

Gausdal G, Gjertsen BT, Fladmark KE, Demol H, Vandekerckhove J, Døskeland SO

Caspase-dependent, geldanamycin-enhanced cleavage of co-chaperone p23 in leukemic apoptosis.

Leukemia 2004 Dec;18(12):1989-96.

PMID: 15483679

Bruserud Ø, Hovland R, Wergeland L, Huang TS, Gjertsen BT

Flt3-mediated signaling in human acute myelogenous leukemia (AML) blasts: a functional characterization of Flt3-ligand effects in AML cell populations with and without genetic Flt3 abnormalities.

Haematologica 2003 Apr;88(4):416-28.

PMID: 12681969

Glenjen N, Hovland R, Wergeland L, Wendelbo Ø, Ernst P, Bruserud Ø

The angioregulatory phenotype of native human acute myelogenous leukemia cells: influence of karyotype, Flt3 abnormalities and differentiation status.

Eur J Haematol 2003 Sep;71(3):163-73.

PMID: 12930316

Oveland E, Gjertsen BT, Fladmark KE, Hovland R.

1. Quantitative proteomics analysis of the THP1 acute myeloid leukemia cell line after long-time stimulation with Flt3 ligand

Intracellular Transport and Signal Transduction in Cancer Biomedicine, Stalheim, The Nærøy Fjord. Norway. May 19th-23th 2007.

Oveland E

1. Quantitative proteomics on leukemia cells stimulated with Flt3 receptor tyrosine kinase ligand

Nordic Proteomics Network, Saka Hotel, Tallinn, August 2007

Oveland E

2. Quantitative proteomics on the THP1 AML cell line after long-time stimulation with Flt3 ligand

BCCR, Solstrand, Bergen. May 4th-5th 2007

Oveland E

3. Use of SILAC to investigate signaling targets of Flt3 receptor tyrosine kinase

The Norwegian Biochemical Society Contact Meeting. February 1th-3th 2007.

Hodneland Linn Iren

Approaches to discover members of the oncogenic Flt3 receptor tyrosine kinase signaling network

Masteroppgave

Wergeland Line, Oveland Eystein, Sjøholt Gry, Hovland Randi, Bruserud Øystein, Gjertsen Bjørn Tore

Protein modulation of Flt3 and Hdm2 by DNA damage, Flt3 ligand and kinase inhibitors in acute myeloid leukemia

Poster. European School of Hematology/AACR , Cascais, Portugal 2006

Oveland Eystein

SILAC to identify signaling targets of Flt3 –a receptor tyrosine kinase often mutated in acute myeloid leukemia

Talk. Quantitative mass spectrometry seminar, Odese, Danmark 2006

Hovland R

Flt3-from gene to protein.

Innlegg. Bergen Conference on Cancer Research

Hovland R

Signalling network induced by mutated Flt3 tyrosine kinase.

National Proteomics Conference. Bergen

Oveland E, Hovland R, Frøyseth AK, Gjertsen BT, Fladmark KE

Mutations in Flt3 receptor tyrosine kinase and altered signaling in acute myeloid leukemia cells

Poster. FEMBS/EMBO course. Molecular mechanisms in signal tranduction in cancer.

Hovland R og Gjertsen BT

Mutasjoner i tyrosin kinasen Flt3 ved akutt myelogen leukemi.

Nordisk Møte i Human Genetikk 2004

Hovland R., Gruber F, Kristoffersen EK, Haug Å, Gradek GA, Zwann M, Bruserud Ø, Gjertsen BT, Bjørke-Monsen A.L.

Therapy induced transition from acute myeloid leukemia with Flt3 length mutations to chronic myeloid leukemia with t(9;22)(q34;q

NOPHO-møte 2004.

Fladmark KE, Solheim E., Oveland E, and Lillholm P-E.

Proteomics Unit at UoB (PROBE): the Norwegian proteomics centre.

NBS Vintermøte 2004

Fladmark KE og Hovland R

Introduksjon i proteomikk

"Verdt å Vite" NRK Radio intervju

Mia Kolbjørnsen

Advances in protein research

UoB International magazine 2003

eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT

Alle henvendelser rettes til Faglig rapportering, Helse Vest

Personvern  -  Informasjonskapsler