Characterization of paraneoplastic antibodies

Autoantistoffer ved paraneoplastisk nevrologisk sykdom.Paraneoplastisk nevrologisk sykdom opptrer som en fjerneffekt av kreft i ca 1 % av alle krefttilfeller. Pasienter med paraneoplasi uttrykker antistoffer mot antigener i kreftsvulsten. Disse antistoffene kan benyttes som markører for tidlig kreftdiagnostisering.Anti-Yo er et av de vanligste paraneoplastiske antistoffene. Det er assosiert med eggstokk- og brystkreft, men kan også detekteres hos pasienter med andre kreftformer. Anti-Yo gjenkjenner cerebellar degeneration-related protein 2, CDR2. mRNA studier har vist at CDR2 mRNA uttrykkes i de fleste vev, men CDR2 protein har tidligere kun vært påvist i Purkinjeceller i hjernen og i ovariekreftvev. En har antatt at posttranslasjonelle mekanismer regulerer proteinuttrykk av CDR2. En mulig teori for paraneoplastiske syndromer har vært at immunsystemet danner antistoff mot CDR2 i kreftsvulsten. Disse antistoffene krysser så blood-hjerne-barrieren og angriper Purkinjecellene i hjernen. Våre studier viser at CDR2 protein uttrykkes i en rekke vev, både normalt og kreftvev i tillegg til en rekke cellelinjer. Dette tyder at det ikke er noen posttranslasjonell regulering av CDR2-uttrykk, og at immunregulering av Yo antistoffsyntese er relatert til antistoffpresentasjon og T-celleregulering. Vi har vist at Yo-antistoff er korrelert til et annet antistoff, anti-CCDC104, som er rettet mot et ukjent protein. Dette er som CDR2 et koilet protein, men med ulike transkripter som finnes i forskjellig vev. Vi har også påvist CCDC104 antistoffer hos pasienter uten kreft og PCD slik at dette antistoffet ikke er direkte knyttet til paraneoplasi CDR2 tilhører CDR-familien som består av CDR1, CDR2 og CDR2L. Lite er kjent om disse proteinene, men både CDR1 og CDR2 er involvert i cerebellær degenerasjon. CDR2 og CDR2L har svært høy sekvenslikhet og kan derfor ha overlappende funksjoner. Vi ønsker å se nærmere på funksjonen til disse proteinene for å bedre kunne forstå deres rolle i cerebellær degenerasjon. Vi vil kartlegge hvilke pasientgrupper som har antistoff mot de ulike CDR-proteinene. Videre vil vi studere proteinekspresjon i ulike vev samt lokalisering av de ulike proteinene i cellekultur. Med dette ønsker vi å få bedre forståelse for mekanismene bak paraneoplastisk nevrologisk sykdom.

Autoantistoffer ved PNSParaneoplastisk nevrologisk syndrom (PNS) opptrer som en fjerneffekt av kreft i ca 1 % av alle krefttilfeller. Pasienter med PNS uttrykker antistoff mot antigener i kreftsvulsten. Antistoffene benyttes som markører for tidlig kreftdiagnostisering. Å lete etter nye antistoffer er viktig for å kunne identifisere flere kreftpasienter tidlig.Paraneoplastiske nevrologiske syndromer (PNS) oppstår som en fjerneeffekt av enkelte typer kreft, spesielt lunge-, eggstokk og brystkreft. Disse syndromene er sjeldne, men klinisk viktige, da pasienter med PNS danner antistoffer mot antigener i kreftsvulsten. Disse antistoffene gjenkjenner også proteiner i hjernen, noe som gir nevrologiske utslag. De nevrologiske symptomene oppstår gjerne før en kreftsvulst oppdages. Antistoffene benyttes derfor som tidlige markører for kreft og gir ofte indikasjoner på hvilken type kreft det gjelder. Å lete etter nye paraneoplastiske antistoffer er viktig for å kunne oppdage flere krefttilfeller på et tidlig tidspunkt. Ved å screene et cerebellum cDNA bibliotek fra rotte mot serum fra pasienter med kreft og PNS ble det identifisert et antistoff mot et hittil uidentifisert protein, coiled-coil domain-containing protein 104 (CCDC104). Funksjonen til dette proteinet er ukjent, men bioinformatiske analyser har vist at dette proteinet er svært godt konservert blant mammalske dyr, og at det sannsynligvis finnes flere ulike isoformer av proteinet. Studier av proteinuttrykking viser at de ulike isoformene er uttrykt i en rekke vev, og at en 39 kDa variant av proteinet er spesielt uttrykt i hjernen og testes. For å undersøke om dette antistoffet er assosiert med bestemte former for kreft har vi screenet serum fra pasienter med ulike former for kreft ved hjelp av en sensitiv radioimmuno-presipiteringsmetode. Resultatet viste at 0,8 % av pasientene med lungekreft, 0,4 % av pasientene med brystkreft og 0,5 % av pasientene med ovariekreft hadde antistoffer mot CCDC104. Videre viste studien at 10 % av pasientene med et annet paraneoplastisk antistoff, anti-Yo, også hadde antistoffer mot CCDC104. Dette tyder på at anti-CCDC104 er et potensielt nytt paraneoplastisk antistoff, muligens assosiert med anti-Yo. Artikkelen skal sendes inn for publikasjon i februar 2009 Vi planlegger å gjøre funksjonelle studies av CCDC104 blant annet ved hjelp av gjær 2-hybrid system. I 2007 publiserte vi en artikkel om forskjell i antistoff aviditet mellom pasienter med to ulike paraneoplastiske antistoffer. Vi fant at antistoff aviditeten varierte innenfor en gruppe pasienter med samme antistoff, samt at de to ulike parneoplastiske antistoffene vi så på hadde ulik aviditet. Vi ønsker å utvide denne studien ved å se på aviditeten til flere paraneoplastiske antistoffer i et større pasientmateriale. Disse studiene som gjelder bruk av en radioimmuno-presipiteringsteknikk pågår og forventes ferdige i løpet av februar 2009. Vi vil også bruke en funksjonell metode ”BiaCore” til å undersøke aviditet. I den forbindelse har vi innledet samarbeid med professor Martinez ved Institutt for biomedisin.

Autoantistoffer ved paraneoplastisk nevrologisk sykdomParaneoplastisk nevrologisk sykdom forekommer ved ca 1 % av alle krefttilfellene. Påvisningen av onkoneurale antistoffer har stor diagnostisk betydning. Prosjektet innebærer karakterisering av slike autoantistoffer og påvisning av nye autoantistoffer som kan brukes diagnostisk.Paraneoplastiske nevrologiske syndromer er sjeldne og oppstår i ca. 1 % av alle krefttilfeller. I mange tilfeller opptrer de nevrologiske symptomene før kreftsvulsten blir oppdaget, og deteksjon av slike antistoffer er et viktig hjelpemiddel for å kunne oppdage svulsten tidlig. Den mest sannsynlige mekanismen for utvikling av paraneoplastisk nevrologisk sykdom er at kreftcellene uttrykker antigener som er identiske med, eller ligner molekyler uttrykt i nerveceller. Kreftsvulsten utløser derved en immunrespons som kryssreagerer med nervevev. Hittil har en stor del av prosjektet gått ut på å undersøke forskjeller i antistoff aviditet blant pasienter med Hu og Yo antistoffer. Dette arbeidet resulterte i artikkelen "Hu and Yo antibodies have heterogeneous avidity" som kom ut i J Neuroimmunol. i april 2007. Denne delen av prosjektet videreutvikles ved å undersøke aviditet for et større materiale, inkludert andre paraneoplastiske antistoffer. Nå arbeides det med å karakterisere et hittil uidentifisert protein som ble oppdaget ved screening av cDNA bibliotek med serum fra pasienter med paraneoplastisk sykdom. Lite er kjent om proteinet, men bioinformatiske analyser av proteinsekvensen antyder at proteinet kan ha en rolle i DNA reparasjon. Vi har vist at dette proteinet er uttrykt i en rekke vev, blandt annet flere områder av hjernen.For å kunne lokalisere proteinet i celler og vev forsøker vi nå å lage antistoffer mot proteinet. For videre karakterisering av proteinets rolle i celler ønsker vi blandt annet å studere proteinet i cellekultur.

Autoantistoffer ved paraneoplastisk nevrologisk sykdomParaneoplastisk nevrologisk sykdom forekommer ved ca 1% av alle krefttilfeller. Påvisning av onkonevrale autoantistoffer er av meget stor diagnostisk verdi. Prosjektet innebærer karakterisering av slike autoantistoffer og påvisning av nye autoantistoffer som kan brukes diagnostisk.Paraneoplastiske nevrologiske sykdommer, også kalt nevrologiske fjerneffekter av kreft, er sjeldne i det de opptrer i ca 1% av alle krefttilfeller. Sannsynligvis er sykdommene underdiagnostiserte, og forskningsgruppen har vist at paraneoplastiske autoantistoffer kan påvises i lang hyppigere forekomst ved ulike kreftformer. Autoantistoffene er av meget stor verdi for å påvise underliggende kreft, som oftest er udiagnostisert når pasientene får symptomer fra nervesystemet. Paraneoplastisk nevrologisk sykdom kan imidlertid også forekomme uten at slike autoantistoffer kan påvises. Autoantistoffenes funksjon ved paraneoplastisk sykdom er lite karakterisert. I dette prosjektet er det påvist at Yo antistoffer har høyere aviditet (bindingsevne) enn Hu antistoffer. Deres aviditet varierer også i sykdomsforløpet. Studien er den første som har karakterisert aviditet av paraneoplastiske autoantistoffer, og resultatene tyder på at Yo antistoffer er av større patogen betydning enn Hu antistoffer. Pasienter med Yo antistoffer har som regel en selektiv affeksjon av lillehjernen, mens pasienter med Hu antistoffer kan ha affeksjon av hele nervesystemet. Ved screening av serum fra pasient med paraneoplastisk sykdom mot et cDNA lillehjerne bibliotek har vi påvist autoantistoffer mot et hittil ukjent protein som finnes cytoplasmatisk i Purkinje celler. Vi har ikke påvist antigenet i annet vev, men videre karaktersiering av både mRNA og protein foregår. I dette inngår også nærmere lokalisering av antigenet med konfokal mikroskopi. Vi har utviklet en in vitro transkripsjons og translasjons teknikk for å screene andre sera på tilsvarende autoantistoff. Det gjenstår å se om dette antistoffet kan brukes i diagnostisk sammenheng. Det er startet forsøk med å karakterisere funksjonell egenskap av et paraneoplastisk antistoff, anti-CRMP5, in vivo i rottemodell. Dette vil også innebære studier av antistoffets rolle på hippocampus celler i kultur, bla hvilke intracellulære funksjoner som påvirkes. Dette er et samarbeidsprosjekt med Professor Clive Bramham ved Institutt for Biomedisin, UiB. Cecilie Totland er for tiden i morspermisjon.

Autoantistoffer ved paraneoplastisk nevrologisk sykdomParaneoplastiske nevrologiske sykdommer oppstår som en fjerneffekt av at kroppen danner antistoffer mot ulike kreftformer. Disse antistoffene angriper også nervevev i hjernen. Gjennom aviditetsundersøkelser av tidligere kjente antistoffer og deteksjon av et nytt antistoff ser vi nærmere på hvilke funksjoner disse antistoffene har i sykdomsutviklingParaneoplastiske nevrologiske sykdommer, også kalt ”nevrologiske fjerneffekter av kreft”, er sjeldne, men klinisk viktige, fordi de nevrologiske symptomene hos 50-70% av pasientene presenterer seg mens den underliggende kreftsvulsten ikke er kjent. Dette betyr at en kan oppdage svulsten i en tidlig fase. Den mest sannsynlige mekanismen for utvikling av paraneoplastiske nevrologiske sykdommer er at kreftcellene uttrykker antigener som er identiske med, eller ligner molekyler uttrykt i nerveceller. Kreftsvulsten utløser derved en immunrespons som ”skyter over mål” og som kryssreagerer med nervevev. I dette prosjektet ser vi nærmere på hvilke funksjoner paraneoplastiske antistoffer har i utviklingen av paraneoplastiske syndrom. Prosjektet er delt opp i tre delprosjekter: 1. Forekomst og aviditet av paraneoplastiske nevrologiske antistoffer ved ulike kreftformer 2. Påvisning av nytt paraneoplastisk nevrologisk antistoff ved hjelp av cDNA bibliotek 3. Funksjonell karakterisering av anti-CRMP5 1. Aviditet er et mål på hvor effektivt et antistoff binder antigen. Aviditetsmålinger benyttes diagnostisk ved blant annet røde hunder og toxoplasmose for å avklare om antistoffene nylig er dannet som følge av ny infeksjon eller om de er rester etter en gammel infeksjon,. Nydannede antistoffer viser ofte lavere aviditet enn antistoffer fra eldre infeksjoner. Aviditet er også vist å kunne påvirke sykdomsforløpet. En mye brukt metode for å undersøke antistoffaviditet er å forsøke å bryte antistoff-antigen-bindingen ved å behandle med ulike konsentrasjoner av denaturanten urea. Vi har videreutviklet en immunopresipiteringsmetode tidligere utviklet ved Nevrologisk forskningslaboratorium til også å kunne benyttes for aviditetsstudier på de to mest utbredte paraneoplastiske antistoffene, Hu og Yo. Vi har sammenlignet forskjeller i aviditet mellom disse antistoffene, og videre undersøkt hvordan aviditeten endrer seg over tid for pasienter med henholdsvis Hu- og Yo-antistoffer. Disse data bearbeides nå for publikasjon. 2. Ved screening av serum fra pasienter med paraneoplastiske syndromer mot et cDNA-bibliotek fant vi antistoffer mot et hittil ukjent protein. Vi har dyrket opp dette proteinet i E.coli og immunisert kaniner med proteinet for antistoffproduksjon. Antistoffene viser binding til Purkinjeceller i cerebellum, noe som tyder på at proteinet er uttrykt her. Vi vil fremover undersøke hvilke andre vev proteinet uttrykkes i, utbredelsen av antistoffet i kreftmaterialet vårt og om dette er en ny kreftmarkør som kan assosieres med bestemte krefttyper og nevrologisk sykdom. 3. Prosjektet med å karakterisere funksjon av et paraneoplastisk antistoff, anti-CRMP5, i en rottemodell er et samarbeidsprosjekt med Professor Clive Bramham ved Institutt for Biomedisin, UiB. Dette prosjektet regner vi med starter opp i 2006.