Glucokinase - the glucose sensor of the pancreatic beta-cell. From crystal structure to diabetes diagnosis and therapy.

Glukokinase – et potensielt mål for behandling av diabetes?Enzymet glukokinase finnes i de insulinproduserende betacellene i bukspyttkjertelen hvor det har en sentral funksjon i reguleringen av blodsukkernivået. Strukturelle og funksjonelle studier av glukokinase kan vise seg viktig for å identifisere nye mekanismer/farmaka for behandling av visse former av diabetes.Kroppens insulinproduksjon finner sted i betacellene i bukspyttkjertelen. Utskillelse av insulin styres delvis av enzymet glukokinase, som i betacellene fungerer som en sensor som registrerer glukosenivået i blodet. Ved forhøyet blodsukkernivå frisettes signalsubstanser som stimulerer til insulinutskillelse, ved lavt blodsukker skrus disse signalveiene av. Ulike mutasjoner i genet som koder for glukokinase gir sykdommer med endret blodsukkernivå som hovedsymptom. MODY2 er en arvelig, ikke-insulinavhengig mild form for diabetes med lett forhøyet blodsukker allerede fra spedbarnsalderen. Denne tilstanden skyldes enkeltfeil i genet som koder for glukokinase og er assosiert med varierende grad av redusert enzymaktivitet. Mer enn 200 MODY2-assosierte mutasjoner er til nå identifisert i pasienter. Diabetesforskningsgruppen ved Barneklinikken har vist at dobbeltmutasjoner i glukokinasegenet gir et fullstendig tap av enzymaktivitet og forårsaker diabetes hos nyfødte barn (Njølstad et al, NEJM, 2001). Dette er en sjelden, men alvorlig tilstand som krever behandling med insulin fra fødselen av. Den motsatte situasjonen eksisterer også hvor feil i dette genet resulterer i økt enzymaktivitet. Dette fører til høy utskillelse av insulin og vedvarende lavt blodsukker allerede fra spedbarnsalder. Det finnes således et bredt spekter av sykdommer assosiert med ulike mutasjoner i glukokinase. Som følge av sin sentrale rolle i glukosestoffskiftet er glukokinase et attraktivt mål for farmakologisk kontroll av blodsukkeret. En rekke små, syntetiske organiske forbindelser med evne til å øke enzymaktiviteten har blitt framstilt. Slike syntetiske forbindelser blir nå testet ut som potensielle nye medikamenter i behandlingen av MODY2, med mulig nytteverdi også for den langt mer utbredte type 2-diabetes. Det spekuleres også i om der eksisterer et naturlig cellulært motstykke til disse syntetiske forbindelsene med tilsvarende aktiverende egenskaper, som er involvert i den molekylære reguleringen av enzymet i cellene. Molekylærbiologiske og biokjemiske metoder har i de senere år fått stor betydning for diabetesforskningen. Kjennskap til den primære og tredimensjonale oppbyggingen av enzymet har åpnet for spennende muligheter til å studere sammenhengen mellom dets struktur og funksjon. I våre studier karakteriserer vi ulike sykdoms-assosierte mutante former av enzymet og sammenligner deres ulike egenskaper med den normale formen. Noen mutasjoner ko-segregerer med diabetes (MODY2) i familien, dvs. at de opptrer kun i de syke familiemedlemmene, og blir således betraktet som sykdomsframkallende. Disse mutante formene av enzymet viser overraskende nok normal aktivitet og interaksjon med kjente cellulære regulatoriske proteiner. De biokjemiske og kliniske konsekvensene av disse mutasjonene er fortsatt uavklart. For oss er det derfor et viktig mål og en stor utfordring å finne nye potensielle regulerings-mekanismer. Vi har nylig vist i en artikkel publisert i Journal of Biological Chemistry i år at glukokinase i insulinproduserende celler reguleres av et lite protein kalt ubiquitin. Dette lille proteinet er en merkelapp som settes på mange ulike proteiner i cellen slik at disse kan gjenkjennes og deres funksjon eller stabilitet reguleres. Vår studie viste at glukokinase interagerer med og aktiveres av frie ubiquitin-kjeder, i samme størrelsesorden som når glukokinase stimuleres av de syntetiske aktivatorene. Vi viste også at ubiquitinering av glukokinase er et signal for nedbryting av nydannet protein i noen spesialiserte organeller i cellen (proteasomer) som bryter ned uønskede eller skadede proteiner. Disse funnene kan representere mulige fysiologiske reguleringsmekanismer for glukokinase-avhengig insulin utskillelse. Ubiquitin-kjeder, enten frie eller bundet til andre proteiner, kan dermed representere en fysiologisk glukokinase aktivator. Vi håper at økt kunnskap omkring den molekylære reguleringen av glukokinase kan bidra til en bedre forståelse av sykdomsmekanismene ved arvelige forstyrrelser i glukosestoffskiftet.

Glukokinase: en sentral regulator av insulinsekresjonenEnzymet glukokinase har en viktig funksjon i regulering av blodsukkernivået. Genfeil som ødelegger dette proteinet, kan derfor forårsake ulike former for arvelig diabetes. Ved hjelp av strukturelle og funksjonelle studier av glukokinase, håper vi å kaste nytt lys over de molekylære mekanismene for hvordan diabetes utviklesGlukokinase er, blant annet, uttrykt i betacellene i bukspyttkjertelen hvor kroppens insulinproduksjon finner sted. Utskillelse av insulin styres delvis av dette enzymet, som fungerer som en sensor som oppfatter glukosenivået i blodet (blodsukkeret). Ved forhøyede glukosenivåer frigis signaler som stimulerer til insulinutskillelse, ved lavt blodsukker skrus disse signalene av. Ulike mutasjoner i genet som koder for glukokinase, gir sykdommer med endret blodsukkernivå som hovedsymptom. MODY2 er en arvelig, ikke-insulinavhengig form for diabetes med lett forhøyet blodsukker. Denne tilstanden er assosiert med redusert aktivitet av glukokinase, og skyldes en enkelt genfeil. I studier utført av MODY-forskningsgruppen ved Haukeland Universitetssykehus og Universitetet i Bergen er det vist at dobbeltmutasjoner i glukokinasegenet kan gi fullstendig tap av enzymaktivitet og forårsake alvorlig diabetes hos nyfødte barn (Njølstad et al, NEJM, 2001). På den andre siden kjenner man også til genfeil som resulterer i økt enzymaktivitet av glukokinase. Dette fører til kronisk utskillelse av insulin og vedvarende lavt blodsukker (hypoglykemi) allerede fra spedbarnsalder. Det finnes altså et spekter av sykdommer assosiert med ulike mutasjoner i GK, noe som understreker dette enzymets avgjørende rolle i glukosestoffskiftet. Glukokinase er derfor et attraktivt mål for farmakologisk kontroll av blodsukkeret. Syntetiske forbindelser som øker enzymaktiviteten er fremstilt og testes nå ut som potensielle nye medikamenter i behandling av diabetes. Kjennskap til den tredimensjonale oppbyggingen av glukokinase har åpnet for spennende muligheter til å studere sammenhengen mellom struktur og funksjon av enzymet, spesielt i relasjon til de ovenfor nevnte sykdommene. I prosjektet karakteriserer vi både den normale formen av enzymet og utvalgte sykdomsmutasjoner med hensyn på biokjemiske egenskaper. Vi har studert effekt av substratbinding og funnet at enzymets strukturelle respons på glukose er endret i mange mutante former av enzymet. Noen enzymvarianter mangler evne til å binde glukose. Andre binder substratet, men på grunn av strukturelle restriksjoner hemmes den påfølgende endringen i proteinets struktur fra en åpen, inaktiv til en lukket, aktiv form, som er viktig i reguleringen av enzymets funksjon. I begge tilfeller er enzymets evne til å omsette glukose svekket. Vårt mål med disse studiene er å oppnå økt kunnskap omkring den molekylære reguleringen av glukokinase, noe som igjen kan gi en dypere forståelse av sykdomsmekanismene ved arvelige forstyrrelser i glukosestoffskiftet.

Glucokinase – glukosesensoren i bukspyttkjertelens betacellerDoktorgradsavhandlingen omhandler studier på enzymet glucokinase som blant annet finnes uttrykt i de insulinproduserende betacellene i bukspyttkjertelen. Prosjektet kan bidra til å kaste nytt lys over de molekylære mekanismene for hvordan diabetes utvikles.Glukokinase (GK) funksjonerer som en sensor i betacellene ved å stimulere utskillelse av insulin som respons på forhøyede nivåer av glukose i blodet. MODY2 er en arvelig, ikke-insulinavhengig form for diabetes med lett forhøyet blodsukker. Denne tilstanden er assosiert med redusert aktivitet av GK, og skyldes en enkelt genfeil i GK. I studier utført av MODY-forskningsgruppen i Bergen (Njølstad et al., N. Engl. J. Med., 2001; Njølstad et al.,Diabetes, 2003) er det vist at dobbeltmutasjoner i dette genet kan gi fullstendig tap av enzymaktivitet og forårsake en alvorlig form for nyfødtdiabetes. Den motsatte situasjonen eksisterer også, hvor enkeltmutasjoner i GK resulterer i økt enzymaktivitet, og derav kronisk økt utskillelse av insulin, noe som leder til vedvarende for lavt blodsukker (hypoglykemi). Det finnes altså et spekter av sykdommer assosiert med ulike mutasjoner i GK, noe som understreker dette enzymets avgjørende rolle i glukosebalansen. GK er et attraktivt mål for farmakologisk kontroll av glukose-stoffskiftet. Nylig ble det oppdaget en klasse syntetiske molekyler som har evnen til å øke aktiviteten til enzymet, og disse GK-aktivatorene har en potensiell nytteverdi i behandlingen av type 2 diabetes. Den tredimensjonale struktur av humant GK er nylig blitt kjent og er et viktig utgangspunkt for det aktuelle prosjekt. Strukturen er et verktøy for å studere sammenhengen mellom struktur og funksjon av GK spesielt i relasjon til MODY2, nyfødt diabetes og hypoglykemi. Den normale formen av enzymet, samt utvalgte sykdomsrelaterte mutasjoner studeres og deres strukturelle og enzymologiske egenskaper karakteriseres. Resultatene forventes å bidra til en dypere forståelse av den molekylære mekanisme for den svekkede funksjonen av enkelte mutante former av enzymet. En sentral problemstilling er å forstå hvorledes binding av glukose til GK initierer en omfattende endring i enzymets struktur (konformasjon) fra en inaktiv til en aktiv form. Dette er en langsom prosess, og kan således studeres i sann tid ved hjelp av ulike biofysiske metoder. Sentralt i prosjektet fram til i dag har vært å evaluere intrinsic tryptophan fluorescence spektroskopi som en slik metode, og resultater så langt har tydelig vist at dette er en svært velegnet og verdifull metode for slike studier. Vi har undersøkt effekt av substratbinding til det normale enzymet og nå står en rekke mutante former av enzymet for tur. Slike konformasjonsstudier av villtype enzymet samt utvalgte mutante former vil bidra til økt forståelse av den molekylære sykdomsmekanisme.