Phenotypic heterogeneity of human glucokinase (MODY2) mutations. Structure, function and regulatory mechanisms

Det er kjent mer enn 600 mutasjoner i genet som koder for glukokinase. Nedarving av en kopi (heterozygot) av en inaktiverende mutasjon fører til en mild form for diabetes (MODY type 2 - Maturity-Onset Diabetes of the Young, også kalt GCK-MODY). Nedarving av to kopier (homozygot) av slike inaktiverende mutasjoner fører til en mer alvorlig form for spedbarnsdiabetes, permanent neonatal diabetes. De fleste GCK-MODY mutasjoner forårsaker diabetes fordi glukokinasen hos disse pasientene har en redusert aktivitet, og glukose vil da ikke lenger brytes ned effektivt. For andre GCK-MODY pasienter fører mutasjonen til diabetes med ukjent mekanisme. Derfor leter vi etter nye, alternative mekanismer for hvordan glukokinasen er regulert i cellen og undersøker om disse er feilregulert hos pasientene og kan således belyse årsaksmekanismen ved GCK-MODY.

I dette studiet, har vi funnet en ny mekanisme for hvordan enzymet glukokinase er regulert v.h.a. den posttranslasjonelle modifikasjonen som kalles SUMOylering. Dette arbeidet ble publisert i JBC i januar 2013 og oppfyller dermed et av prosjektets delmål: “identifisere posttranslasjonelle modifikasjoner og dens regulatoriske egenskaper av glukokinase”. Vi har vist at SUMOylering stabiliserer og aktiverer pankreas isoformen av enzymet, men har mindre innvirkning på lever isoformen. Dermed oppfyller dette studiet også et av delmålene for prosjektet som var beskrevet som “komparative studier av de regulatoriske egenskapene til lever og pankreas isoformen av glukokinase”. SUMOylering kan dermed se ut til å være en endogen aktiveringsform for pankreas glukokinase, noe som i seg selv kan være interessant m.h.t. behandling av type 2 diabetes (oppfyller da også delmålet: ”fortsettelse av søk etter og karakterisering av endogene glukokinase aktivatorer”).

I prosjektperioden har jeg også vært med på 3 andre relevante studier, som ble publisert i FEBS J i 2011, BBA i 2012 og Mol. Cell. Endocrinol i januar 2014. Arbeidet i FEBS J viser at binding av liganden ATP til glukokinase fører til en konformasjonsendring i enzymet og gir bedre mekanistisk forståelse av hvordan enzymet fungerer (oppfyller da delmålet: ”videre karakterisering av katalytiske egenskaper av glukokinase”). I arbeidene i BBA og Mol. Cell. Endocrinol. har vi vist at noen GCK-MODY mutasjoner (S263P, G264S og R275C) fører til protein misfolding, noe som gir nedsatt stabilisering av de mutante proteinene og aggregering i celler. Økt nedbryting av mutert glukokinase enzym kan derfor bli utfallet og kan dermed være årsak til GCK-MODY i disse familiene.

Konklusjon: I dette prosjektet har vi funnet nye mekanismer for hvordan glukokinase reguleres (SUMOylering), noe som fortrinnsvis skjer med pankreas isoformen. Videre studier trengs for å finne ut hvordan SUMOylering påvirker glukokinases regulering av sukker metabolismen og insulin sekresjon. I tillegg har vi vist nye mekanismer for hvordan enkelte GCK-MODY mutasjoner gir sykdom, nemlig at sykdommen skyldes protein misfolding og aggregering. Samlet kan vi konkludere med at dette studiet gir oss økt forståelse for et meget sentralt enzym som er involvert i diabetes og også nye forklaringer for hvorfor noen pasienter blir syke.

Diabetes er en sykdom som er en helseutfordring og som forventes å øke i omfang årene fremover. I henhold til verdens helseorganisasjon, så led i år 2000 171 millioner mennesker av diabetes verden rundt, et antall man forventer vil stige til 366 millioner i 2030. Glukokinase har lenge vært et attraktivt mål for type 2 diabetes terapi, hvor man leter etter forbindelser/molekyl som kan aktivere glukokinasen, og på denne måten få redusert glukose-nivået i pasienten. Vi har funnet en slik aktiverende mekanisme i form av SUMOylering, noe som på sikt kan ha betydning for pasienter med type 2 diabetes. Videre studier blir viktig for å se hvordan SUMOylering reguleres og hvordan man spesifikt kan målrette behandlingen mot glukokinase. Dette studiet er også viktig fordi det har gitt en ny forståelse for mekanismene for sykdom for noen av formene for GCK-MODY diabetes og dette kan også gi ståsted for utvikling av videre medikamenter. Kan man for eksempel finne molekyl som kan hindre aggregering av glukokinase mutanter sett i disse pasientene, kan dette være en vei å gå videre i behandlingen av disse. Funnene kan også være relevant for behandling av generell type 2 diabetes, hvor man tenke seg målrettet behandling som går spesifikt mot å øke GK løselighet/protein stabilitet.

Blodsukkernivået er nøye regulert for at viktige funksjoner i kroppen skal ivaretas slik at det ikke skal utvikles sykdom. Lever og bukspyttkjertel står sentralt i denne reguleringen hvor deres felles enzym glukokinase omdanner glukose til glukose-fosfat. Glukokinase er et nøkkelenzym i leverens regulering av blodsukkernivået (normalt 4-8 mmol/l) og i reguleringen av beta-cellenes frisetting av insulin (”glukose sensor funksjon”). Dette er årsak til at glukokinase er ansett som et viktig målprotein i behandling av type 2 diabetes, hvor man prøver å finne molekyler som ved binding til glukokinasen kan aktivere enzymet og således senke blodsukkernivået.

Det er kjent mer enn 600 mutasjoner i genet som koder for glukokinase. Nedarving av en kopi (heterozygot) av en inaktiverende mutasjon fører til en mild form for diabetes (MODY type 2 - Maturity-Onset Diabetes of the Young, også kalt GCK-MODY). Nedarving av to kopier (homozygot) av slike inaktiverende mutasjoner fører til en mer alvorlig form for spedbarnsdiabetes, permanent neonatal diabetes. De fleste GCK-MODY mutasjoner forårsaker diabetes fordi glukokinasen hos disse pasientene har en redusert aktivitet, og glukose vil da ikke lenger brytes ned effektivt. For andre GCK-MODY pasienter fører mutasjonen til diabetes med ukjent mekanisme. Derfor leter vi etter nye, alternative mekanismer for hvordan glukokinasen er regulert i cellen og undersøker om disse er feilregulert hos pasientene og kan således belyse årsaksmekanismen ved GCK-MODY.

Vi har funnet en ny mekanisme, SUMOylering av glukokinase, som øker enzymets aktivitet og stabilitet i beta-celler og kan således spille en viktig rolle i reguleringen av cellenes insulin sekresjonen. Vårt arbeid viser at SUMO proteinet kan være en potensiell fysiologisk aktivator/stabilisator for glukokinase, og kan dermed være av betydning for forskningen rettet mot glukokinase i behandling av type 2 og GCK-MODY diabetes.

Videre jobbes det med å undersøke en interessant sammenheng mellom beta-cellens glukose metabolisme og programmert celledød (apoptose). Dette arbeidet ble startet da Ingvild Aukrust var gjesteforsker (i ett år) ved Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School, i Boston (USA) under veiledning av Dr. Rohit N. Kulkarni fra august 2009. I mitokondriene er glukokinase funnet i et kompleks sammen med bl.a. det apoptose-fremmende proteinet BAD, og denne interaksjonen ser ut til å være med på å regulere beta-celledød (apoptose), noe som er svært relevant ved både type 1 og type 2 diabetes. Vi ønsker primært å studere om noen av GCK-MODY mutantene viser en endret binding til mitokondriet og BAD proteinet, og om dette kan forklare mekanismen bak sykdommen hos disse pasientene, og hvordan denne interaksjonen er regulert.

Blodsukkernivået er nøye regulert for at viktige funksjoner i kroppen skal ivaretas slik at det ikke skal utvikles sykdom. Lever og bukspyttkjertel står sentralt i denne reguleringen hvor deres felles enzym glukokinase omdanner glukose til glukose-fosfat. Glukokinase er et nøkkelenzym i leverens regulering av blodsukkernivået (normalt 4-8 mmol/l) og i reguleringen av beta-cellenes frisetting av insulin (”glukose sensor funksjon”). Det meste av enzymet (95 %) finnes i leveren, der det har en sentral funksjon i lagringen av glykogen ved økt blodsukkernivå.

Det er kjent mer enn 600 mutasjoner i genet som koder for glukokinase. Heterozygote, inaktiverende mutasjoner resulterer oftest i en mild form av diabetes (MODY type 2 - Maturity-Onset Diabetes of the Young, også kalt GCK-MODY), mens homozygote, inaktiverende mutasjoner fører til en mer alvorlig form for diabetes, permanent neonatal diabetes. De fleste GCK-MODY mutasjoner forårsaker diabetes fordi glukokinasen hos disse pasientene har en redusert aktivitet, og glukose vil da ikke lenger brytes ned effektivt. For andre GCK-MODY pasienter fører mutasjonen til diabetes med ukjent mekanisme. Derfor leter vi etter nye, alternative mekanismer for hvordan glukokinasen er regulert i cellen og undersøker om disse er feilregulert hos pasientene og kan således belyse årsaksmekanismen ved GCK-MODY.

Glukokinase er et viktig målprotein i behandling av type 2 diabetes, hvor man prøver å finne molekyler som ved binding til glukokinasen kan aktivere enzymet og således senke blodsukkernivået. Vi har oppdaget en ny mekanisme, SUMOylering av glukokinase, som øker enzymets aktivitet og stabilitet i beta-celler og kan således spille en viktig rolle i reguleringen av cellenes insulin sekresjonen. Vårt arbeid viser at SUMO proteinet kan være en potensiell fysiologisk aktivator/stabilisator for glukokinase, og kan dermed være av betydning for forskningen rettet mot glukokinase i behandling av type 2 og GCK-MODY diabetes.

Videre jobbes det med å undersøke en interessant sammenheng mellom beta-cellens glukose metabolisme og programmert celledød (apoptose). Dette arbeidet ble startet da Ingvild Aukrust var gjesteforsker (i ett år) ved Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School, i Boston (USA) under veiledning av Dr. Rohit N. Kulkarni fra august 2010. I mitokondriene er glukokinase funnet i et kompleks sammen med bl.a. det apoptose-fremmende proteinet BAD, og denne interaksjonen ser ut til å være med på å regulere beta-celledød (apoptose), noe som er svært relevant ved både type 1 og type 2 diabetes. Vi ønsker primært å studere om noen av GCK-MODY mutantene viser en endret binding til mitokondriet og BAD proteinet, og om dette kan forklare mekanismen bak sykdommen hos disse pasientene.

Blodsukkernivået er nøye regulert for at viktige funksjoner i kroppen skal ivaretas slik at det ikke skal utvikles sykdom. Lever og bukspyttkjertel står sentralt i denne reguleringen hvor deres felles enzym glukokinase omdanner glukose til glukose-fosfat. Glukokinase er et nøkkelenzym i leverens regulering av blodsukkernivået (normalt 4-8 mmol/l) og i reguleringen av beta-cellenes frisetting av insulin (”glukose sensor funksjon”). Det meste av enzymet (95 %) finnes i leveren, der det har en sentral funksjon i lagringen av glykogen ved økt blodsukkernivå.

Det er nå kjent mer enn 600 mutasjoner i genet som koder for glukokinase. Heterozygote, inaktiverende mutasjoner resulterer oftest i en mild form av diabetes (MODY type 2 - Maturity-Onset Diabetes of the Young, også kalt GCK-MODY), mens homozygote, inaktiverende mutasjoner fører til en mer alvorlig form for diabetes, permanent neonatal diabetes. De fleste GCK-MODY mutasjoner forårsaker diabetes fordi glukokinasen hos disse pasientene har en redusert aktivitet, og glukose vil da ikke lenger brytes ned effektivt. For andre GCK-MODY pasienter fører mutasjonen til diabetes med ukjent mekanisme. Derfor leter vi etter nye, alternative mekanismer for hvordan glukokinasen er regulert i cellen og undersøker om disse er feilregulert hos pasientene og kan således belyse årsaksmekanismen ved GCK-MODY. Glukokinase er også et viktig målprotein i behandling av type 2 diabetes, hvor man prøver å finne molekyler som ved binding til glukokinasen kan aktivere enzymet og således senke blodsukkernivået. Vi har oppdaget en ny mekanisme, SUMOylering av glukokinase, som øker enzymets aktivitet og stabilitet i beta-celler og kan således spille en viktig rolle i reguleringen av cellenes insulin sekresjonen. Vårt arbeid viser at SUMO proteinet kan være en potensiell fysiologisk aktivator/stabilisator for glukokinase, og kan dermed være av betydning for forskningen rettet mot glukokinase i behandling av type 2 og GCK-MODY diabetes.

Videre jobbes det med å undersøke en interessant sammenheng mellom beta-cellens glukose metabolisme og programmert celledød (apoptose). Dette arbeidet ble startet da Ingvild Aukrust var gjesteforsker (i ett år) ved Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School, i Boston (USA) under veiledning av Dr. Rohit N. Kulkarni fra august 2010. I mitokondriene er glukokinase funnet i et kompleks sammen med bl.a. det apoptose-fremmende proteinet BAD, og denne interaksjonen ser ut til å være med på å regulere beta-celledød (apoptose), noe som er svært relevant ved både type 1 og type 2 diabetes. Vi ønsker primært å studere om noen av GCK-MODY mutantene viser en endret binding til mitokondriet og BAD proteinet, og om dette kan forklare mekanismen bak sykdommen hos disse pasientene.

Blodsukkernivået er nøye regulert for at viktige funksjoner i kroppen skal ivaretas og for at det ikke skal utvikles sykdom. Lever og bukspyttkjertel står sentralt i denne reguleringen hvor deres felles enzym glukokinase omdanner glukose til glukose-fosfat. Glukokinase er et nøkkelenzym i leverens regulering av blodsukkernivået (normalt 4-8 mmol/l) og i reguleringen av beta-cellenes frisetting av insulin (”glukosesensor-funksjon”). Det meste av enzymet (95 %) finnes i leveren, der det er sentralt i lagringen av glykogen ved økt blodsukkernivå.

Det er kjent mer enn 600 mutasjoner i glukokinasegenet. Heterozygote, inaktiverende mutasjoner resulterer oftest i en mild form for diabetes (MODY type 2 - Maturity-Onset Diabetes of the Young, også kalt GCK-MODY), mens homozygote, inaktiverende mutasjoner fører til en mer alvorlig form for diabetes, permanent neonatal diabetes. For å forstå de molekylære mekanismer for funksjonstapet ved de inaktiverende mutasjonene benyttes et bredt spekter av proteinkjemiske, biofysiske og cellebiologiske metoder. En spesiell fokus er på de mutasjonene hvor funksjonstapet kan være relatert til post-translasjonelle modifikasjoner eller cellulær ustabilitet av enzymet, eller at mutasjoner kan endre enzymets binding til interaksjonspartnere, som det pro-apoptosiske proteinet BAD i mitokondriet. Lite er kjent om mekanismen for interaksjonen mellom BAD og glukokinase samt dets funksjonelle betydning for cellens glukosemetabolisme og mulig kobling til programmert celledød (apoptose). Studiet av BAD/GK-komplekset i mitokondriene blir nå utført ved Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School, i Boston, USA, hvor Ingvild Aukrust jobber 1 år under veiledning av Dr. Kulkarni. Hans gruppe har studert BAD/GK-komplekset grundig i flere typer relevante celler, og deres ekspertise vil dermed være til stor fordel for prosjektet.

Når en studerer glukokinase i laboratoriet (både det normale enzym og de mutante former), overuttrykkes enzymet ofte i bakterien E. Coli for å kunne produsere det i store mengder, og deretter renses det ved spesifikke metoder. Når en videre studerer funksjonen til de mutante diabetes-assosierte formene finner en som oftest at enzymaktiviteten er redusert, men i noen tilfeller er enzymaktiviteten normal, til tross for at pasientene har diabetes. Det er derfor nødvendig å lete etter andre forklaringer for tapet av funksjon. Proteiner som lages i kroppen (kontra i E. Coli) får ofte endrete egenskaper ved post-translansjonelle modifiseringer som i mange tilfeller fører til at det samme protein kan ha ulike funksjoner i cellen, alt etter behov. Vi publiserte i 2007 en artikkel i Journal of Biological Chemistry som viste at glukokinase i insulin-produserende celler blir modifisert ved at et lite protein, ubiquitin, festes til enzymet. En slik ubiquitin-merking er ofte et signal om at proteinet er uønsket eller skadet (ved mutasjon) og må brytes ned av cellulære strukturer som kalles proteasomer. Ubiquitinering av glukokinase er nettopp et slikt signal for nedbrytning og kan vise seg mer aktiv i forhold til de muterte former av enzymet.

En annen post-translasjonell modifisering av glukokinase som vi arbeider med er SUMOylering. SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) er et lite protein som i struktur likner ubiquitin, og som kan festes til proteiner på samme måte som ubiquitin. I motsetning til ubiquitinering er ikke SUMOylering et direkte signal om at proteinet skal brytes ned, men det kan bl.a. endre proteinets cellulære lokalisering, stabilitet og aktivitet. Vi har nå vist at glukokinase også SUMOyleres og at glukokinase fra bukspyttkjertel blir bedre SUMOylert enn glukokinase fra lever. Studiene våre tyder også på at SUMOylering kan ha en stabiliserende effekt på glukokinase, kan øke enzymets aktivitet og kan også være involvert i subcellulær lokalisering av glukokinase. Disse studier vil gi større forståelse av hvordan glukokinase reguleres i cellen, og videre undersøkelser vil vise hvorvidt muterte (pasient) former av glukokinase reguleres forskjellig av SUMO enn det normale enzymet.

Blodsukkernivået er nøye regulert for at viktige funksjoner i kroppen skal ivaretas og for at det ikke skal utvikles sykdom. Lever og bukspyttkjertel står sentralt i denne reguleringen hvor deres felles enzym glukokinase omdanner glukose til glukose-fosfat. Glukokinase er et nøkkelenzym i leverens regulering av blodsukkernivået (normalt 4-8 mmol/l) og i reguleringen av beta-cellenes frisetting av insulin (”glukose sensor funksjon”). Det meste av enzymet (95 %) finnes i leveren, hvor det står sentralt i lagringen av glykogen ved økt blodsukkernivå.

Mer enn 200 mutasjoner i glukokinase genet er kjent. Heterozygot inaktiverende mutasjoner resulterer oftest i en mild form av diabetes (MODY type 2 - Maturity-Onset Diabetes of the Young), mens homozygot inaktiverende mutasjoner fører til en mer alvorlig permanent neonatal form av diabetes. Aktiverende mutasjoner derimot fører til hyperinsulinisme og for lavt blodsukker. Molekylær-genetiske analyser er således grunnlaget for de aktuelle studier av mutasjoner i glukokinase genet. For å forstå de molekylære mekanismer for funksjonstapet ved de inaktiverende mutasjoner anvendes et bredt spekter av proteinkjemiske, biofysiske og cellebiologiske metoder. I det aktuelle prosjekt er det spesielt fokus på de mutasjoner hvor funksjonstapet kan være relatert til posttranslasjonelle modifikasjoner og cellulær ustabilitet av glukokinasen.

Når man studerer glukokinasen i laboratoriet (både det normale og mutante former), uttrykkes enzymet ofte i E. coli bakterier for å produsere det i store mengder, og deretter renses det ved spesifikke metoder. Når man videre studerer funksjonen til de mutante former ser man ofte at enzymaktiviteten er normal, til tross for at pasientene har diabetes. Dette har generert et behov for å lete etter andre forklaringer for tapet av funksjon. Proteiner som lages i kroppen får ofte endrete egenskaper ved en prosess som kalles post-translansjonelle modifiseringer. I mange tilfeller fører det til at det samme protein kan ha ulike funksjoner i cellen, alt etter behov. Bakterier bearbeider ikke proteiner på samme måte som humane celler, og derfor vil proteiner som er produsert i E. coli ikke gi et helt reelt bilde av hvordan proteinet fungerer hos mennesket. Vi publiserte i 2007 en artikkel i Journal of Biological Chemistry som viste at glukokinase i insulin-produserende celler blir modifisert ved at et lite protein, ubiquitin, festes (konjugeres) til glukokinase. En slik ubiquitin-merking er ofte et signal om at proteinet er uønsket eller skadet og må brytes ned av cellulære strukturer som kalles proteasomer. Ubiquitinering av glukokinase er nettopp et slikt signal for nedbrytning. Ubiquitin-merking kan også påvirke andre egenskaper ved proteinet. Vår studie viste også at glukokinase binder og aktiveres av frie ubiquitin-kjeder, noe som kan bety at ubiquitin kan være en fysiologisk aktivator for glukokinase.

En annen post-translasjonell modifisering av glukokinase som vi arbeider med er SUMOylering. SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) er et lite protein som i struktur likner på ubiquitin, og som kan festes (konjugeres) til proteiner på samme måte som ubiquitin. I motsetning til ubiquitinering er ikke SUMOylering et signal om at proteinet skal brytes ned, men kan endre proteinets cellulære lokalisering, stabilitet og aktivitet. Ofte fører SUMOylering til at proteinet endrer hvilke partnere det interagerer med. Vi har nå vist at glukokinase også blir modifisert av SUMO, og vi ønsker videre å studere hvordan denne modifikasjonen påvirker glukokinasen i beta-cellen. Det er kjent at beta-cellen utsettes for et betydelig stress ved diabetes og at SUMOylering av proteiner ofte sees ved cellulært stress. Det er derfor interessant for oss å studere om metabolsk stress i beta-celler fører til SUMOylering av glukokinase. I tillegg ønsker vi å undersøke hvordan lav/høy glukose kan påvirke SUMOylering av glukokinase, og hvorvidt SUMO kan virke som en fysiologisk aktivator av glukokinase, slik vi har vist for ubiquitin.