Translational HIV research: infectious molecular clones as tools for drug sensitivity testing
Prosjekt
- Prosjektnummer
- 911419
- Ansvarlig person
- Birgitta Åsjö
- Institusjon
- Universitetet i Bergen
- Prosjektkategori
- Korttidsprosjekt
- Helsekategori
- Infection
- Forskningsaktivitet
- 4. Detection and Diagnosis
Rapporter
Målet å bestemme genotypen til de to fenotypene av HIV ”Rapid/High” (r/h) og ”Slow/Low” (s/l). Teknologien som blir etablert i dette arbeidet skal så brukes i det ultimative målet: Å utvikle et opplegg for raskt å kunne karakterisere isolater fra pasienter med hensyn til hvordan sensitiviteten for medikamentell behandling er hos gitte pasienterVirus av de to ulike fenotyper er blitt dyrket og infeksjonsprofilen er karakterisert med immunfluorescensteknologi der antisera fra anonymiserte HIV positive personer ble benyttet. Analysen viste klare forventede forskjeller med dem to fenotyper og bekreftet egenskapene til de ulike virusgruppene. Dette ble gjort for å verifisere at arbeidet ble gjort med rette virustyper.
Basert på tidligere publiserte sekvenser av ulike varianter av HIV fra andre laboratorier og tilgjengelige på internett ble bioinformatiske analyser utført for ulike strategier for PCR amplifisering av HIV sekvenser fra biologisk materiale. De aktuelle oligonukleotider (primers) ble bestilt og innkjøpt. Oligonukleotidene ble så testet i forskjellige kombinasjoner i PCR reaksjoner der tilgjengelige molekylære viruskloner ble benyttet som templat.
Konklusjonen på dette var at valget av oligonukleotider skulle kunne virke ved PCR av HIV fra det biologiske materialet som skulle analyseres.
I prosjektets andre år ble det fokusert på optimalisering av sensitiviteten for å få fram sekvenser fra celler infiserte med virus av fenotype ”rapid/high”. I denne sammenheng blei sekvenser fra ulike områder av virus amplifisert. Ulike områder gav ulik grad av sensitivitet og dette skyldes mest sansynlig valg av primers. For gag-pol området var det muligt å amplifisere og sekvensere fragmenter opp til 2000 baser. Størst sekvensvariasjon blei observert i området som koder for matrix-proteinet MA. Dette er interessant siden den delen av Gag-proteinene kan være med å bestemme fenotypen ”slow/low”.
Prosjektet ble videreført og avsluttet i det tredje året (2010). De amplifiserte sekvenser fra Gag-genet ble ligert inn i virusvektorer og disse ble så transfekterte til 292T celler. Supernatanten ble så tilsatt aktiverte lymfocytter. Med kontrollplasmidene som koder for rapid/high fenotypen ble det påvist virusproduksjon etter transfeksjon. Dette viser at det skisserte opplegget fungerer og er rasjonelt for den aktuelle problemstilling. Men, de rekombinante plasmider gav emellertid ikke virusproduksjon. Årsakene til dette er ikke helt klare og det var ikke mulig å etterprøve forsøkene da mastergradstudenten som gjorde dette arbeidet avsluttet sitt studium.
Prosjektet er altså videreført med 3 mastergradsstudenter. Arbeidet har vist at konseptet og problemstillingene det først ble søkt støtte til er fult gjennomførbare men at resursene som kreves er større enn den bevilgningen som ble gitt fra HelseVest. Det er nå produsert virus av begge de to fenotypene og målet er å arbeide videre med de aktuelle problemstillingene da vi mener de er både av teoretisk og praktisk klinisk verdi i framtiden
Målet er å bestemme genotypen til de to HIV fenotypene ”Rapid/High”(r/h) og ”Slow/Low” (s/l). Den teknologien som blir etablert i dette arbeidet skal så brukes i det ultimative målet: Å utvikle et opplegg for raskt å kunne karakterisere isolater fra pasienter med hensyn til hvordan sensitiviteten for medikamentell behandling er hos gitte pasienter.Virus av de to ulike fenotyper er blitt dyrket og infeksjonsprofilen er karakterisert med immunfluorescensteknologi der antisera fra anonymiserte HIV positive personer ble benyttet. Analysen viste klare forventede forskjeller med de to fenotyper og bekreftet egenskapene til de ulike virusgruppene. Dette ble gjort for å verifisere at arbeidet ble gjort med rette virustyper. Videre ble ulike strategier for kloning av virus valgt, de nødvendige kits innkjøpt og testet. Det viste seg at kittene ikke fungerte optimalt for prosjektets formål og svært mye tid gikk med til å teste hvor problemene låg og hvordan kloningsstrategier kunne optimaliseres. Basert på uforholdsmessig mange negative resultater er nå en bedre strategi utviklet. I prosjektets andre år har arbeidskraften bestått av to masterstudenter; tilsamen vel ett års arbeidsinnsats.
Mastergradstudent Eikeland fokuserte på optimalisering av sensitiviteten for å få fram sekvenser fra celler infiserte med virus av fenotype ”rapid/high”. I denne sammenheng blei sekvenser fra ulike områder av virus amplifisert. Ulike områder gav ulik grad av sensitivitet og dette skyldes mest sansynlig valg av primers. For gag-pol området var studenten i stand til å amplifisere og sekvensere fragmenter opp til 2000 baser. Størst sekvensvariasjon blei observert i området som koder for matrix-proteinet MA. Dette er interessant siden den delen av Gag-proteinene kan være med å bestemme fenotypen ”slow/low”. Den andre studenten som vil vere med i prosjektet til juni 2010 har nå fått laget molekylære kloner av dette området og er for tiden opptatt med å få disse inn i hele virussekvensen som vi har på plasmid.
Videre arbeid på prosjektet:
Selv om prosjektet har gitt begrensede resultater så langt har prosjektmidlene fra Helse Vest gjort det mulig å starte opp dette prosjektet. Det har gitt praktisk og nyttig erfaring som det nå vil bygges videre på. Spesielt har det vært mulig å få amplifisert sekvenser fra Gag-genet og disse blir nå satt inn i en infeksiøs klon.
Prosjektet blir nå altså videreført med mastergradsstudenter som den viktigste arbeidskraft og driftsmidler blir søkt på fra forskjellige kilder da det har stor prioritet hos seniorforskerne på prosjektet.
En vesentlig fokus i 2010 vil være å få opp sekvenser fra gag-området fra virus med fenotype slow/low og så benytte samme strategi som vi nå arbeider med for å lage viruskloner med elementer av denne fenotype for testing i relevante celletyper slik før beskrevet i den opphavlige prosjektsøknaden.
Prosjektet har to hovedmål. 1) å bestemme genotypen til de to fenotypene av humant immunsviktvirus (HIV) ”Rapid/High” (r/h) og ”Slow/Low” (s/l). 2) å utvikle et opplegg for raskt å kunne karakterisere HIV isolater fra pasienter med hensyn til hvordan sensitiviteten for antiviral medikamentell behandling er hos gitte pasienters virus.Virus av de to ulike fenotyper er blitt dyrket og infeksjonsprofilen er karakterisert med immunfluorescensteknologi der antisera fra anonymiserte HIV positive personer ble benyttet. Analysen viste klare forventede forskjeller mellom de to fenotyper og bekreftet egenskapene til de ulike virusgruppene. Dette ble gjort for å verifisere at arbeidet ble gjort med rette virustyper.
Basert på tidligere publiserte sekvenser av ulike varianter av HIV fra andre laboratorier og tilgjengelige på internett ble bioinformatiske analyser utført for ulike strategier for PCR amplifisering av HIV sekvenser fra biologisk materiale. De aktuelle oligonukleotider (primers) ble bestilt og oligonukleotidene ble så testet i forskjellige kombinasjoner i PCR reaksjoner der tilgjengelige molekylære viruskloner ble benyttet som templat.
Videre ble ulike strategier for kloning av virus valgt, de nødvendige kits innkjøpt og testet. Det viste seg at kittene ikke fungerte optimalt for prosjektets formål og svært mye tid gikk med til å teste hvor problemene låg og hvordan kloningsstrategier kunne optimaliseres. Basert på uforholdsmessig mange negative resultater er nå en bedre strategi utviklet.
Virussekvenser ble forsøkt isolert fra både virussupernatanter (som RNA) og fra infiserte celler (som DNA) og de isolerte nukleinsyrene ble forsøkt brukt som templat for amplifisering av de aktuelle virus. Problemet var at det var vanskelig å reprodusere forsøkene når positive signaler ble oppnådd. Av den grunn ble alternative ekstraksjonsmetoder prøvd og alternative kits innkjøpt for slike ekstraksjoner. Dessverre er det slik at de kommersielt tilgjengelige metodene (kits) for ekstraksjon ikke er så optimale som produsenterne påstår. Svært mye ressurser gikk til å finne optimale ekstraksjonsmetoder. Et annet problem her er mengden virus i de infiserte kulturer. Det vil nå bli gjort forsøk med å starte med større kulturer som basis for ekstraksjon.
Videre arbeid på prosjektet:
Selv om prosjektet har gitt begrensede resultater så langt har prosjektmidlene fra Helse Vest gjort det mulig å starte opp dette prosjektet. Det har gitt praktisk og nyttig erfaring som det nå vil bygges videre på. Spesielt har det vært mulig å få amplifisert sekvenser fra Gag-genet og disse vil nå bli satt inn i en infeksiøs klon.
eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT
Alle henvendelser rettes til Faglig rapportering, Helse Vest