Analyse av blandede DNA chromatogrammer og anvendelsen av dette i medisinsk mikrobiologi

Dyrkningsuavhengi påvisning av bakterier hos infeksjonspasienterPåvisning av bakterie-DNA i prøver fra pasienter med alvorlige infeksjoner gjør det mulig å identifisere bakterier uten å måtte dyrke dem i laboratoriet først. Vi har videreutviklet denne metodikken slik at den nå er nyttig hos langt flere pasienter enn tildigere.Å kunne påvise og identifisere bakterier i pasientprøver uten å behøve å dyrke dem først er meget nyttig hos pasienter som har fått en eller flere doser med antibiotika før prøven ble tatt. Det er også nyttig i forhold til en lang rekke mikrober som er sårbare for kulde og oksygen og for bakterier med helt spesielle vekstkrav som for eksempel Chlamydia og Mycoplasma arter. Vi påviser og leser bakterie-DNA i pasientprøver med en metode som kalles direkte sekvensering. Tidligere kunne man bare tolke et funn av bakterie-DNA i prøver som inneholdt en enkelt bakterieart. Som de eneste i verden har vi utviklet og kommersialisert et databasert DNA-analyse verktøy (RipSeq) som gjør det mulig å tolke en blanding av DNA fra flere ulike bakterie arter. Dette er avgjørende i forhold til en lang rekke alvorlige infeksjoner som ofte forårsakes av mer enn en bakterie. Eksempler på dette kan være infeksjoner i hjernen, i leveren eller i lungehulen. Disse pasientene har ofte fått antibiotika før man får tatt de nødvendige prøver og tradisjonell diagnostikk som baserer seg på dyrkning av levende bakterier blir dermed svært upåliterlig og tidvis misvisende. Våre studier viser at ved alvorlige infeksjonstilstander der pasienten har fått antibiotika før prøvetaking bør direkte sekvensering alltid anvendes. Vi har sett på over 250 pasientprøver og vist en rekke ganger at sekvensering alene finner bakterier som har direkte konsekvenser for behandling av pasienten. I tillegg har vi vist for flere typer infeksjoner at disse er mer komplekse enn det man tidligere har anntatt basert på dyrkningssvar alene. Dette kan få konsekvenser for de generelle antibiotikaretningslinjene, det vil si den behandlingen man velger basert på erfaring før man har fått svar fra laboratoriet. Vi har også arbeidet med å optimalisere selve sekvenseringsprosessen. Vi blant annet vist at det for komplekse infeksjoner ikke er tilstrekkelig med en enkelt sekvenseringsreaksjon som skal finne alle bakterier, men at man heller bør fordele deteksjonen på ulike sekvenseringsreaksjoner. Når vi testet dette på et utvalg alvorlige blandingsinfeksjoner fant vi 80 % flere bakterietyper med den nye fremgangsmåten. Vi har også arbeidet med alternativt primer design (dual_priming_oligonucleotides) for å unngå co-amplifikasjon av humant DNA når vi amplifiserer det bakterielle 16S genet fra pasientprøver (cross-kingdom amplification). Co-amplifikasjon av humant DNA er et stort problem og kan føre til både falskt negative og falskt positive prøvesvar. Medisinsk mikrobiologi bør ha som mål å bli så påliterlig at svarene kan brukes til å skreddersy behandlingen for den enkelte pasient. Dette er viktig for å redusere antibiotikabruken og dermed faren for resistensutvikling, men også for å kunne redusere forkomsten av bivirkninger hos pasientene. Våre studier viser at tradisjonell dyrkningsbasert diagnostikk på langt nær er godt nok alene og at optimal bruk av DNA sekvenseringsutstyr som allerede finnes på de fleste universitetssykehus kan ta diagnostikken et langt og viktig skritt videre. Submittet 2011: Dual-priming oligonucleotides for broad-range amplification of the bacterial 16S rRNA gene directly from human clinical specimens Øyvind Kommedal, Keith Simmon, Dilek Karaca, Nina Langeland, Harald G. Wiker Journal of Clinical Microbiology

Ny diagnostikk for alvorlige bakterieinfeksjonerPåvisning av bakterie-DNA i prøver fra pasienter med alvorlige infeksjoner gjør det mulig å identifisere bakterier uten å måtte dyrke dem i laboratoriet først. Vi har videreutviklet denne metodikken slik at den nå er nyttig hos langt flere pasienter enn tildigere.Å kunne påvise og identifisere bakterier i pasientprøver uten å behøve å dyrke dem først er meget nyttig hos pasienter som har fått en eller flere doser med antibiotika før prøven ble tatt. Det er også nyttig i forhold til en lang rekke mikrober som er sårbare for kulde og oksygen og for bakterier med helt spesielle vekstkrav som for eksempel Chlamydia og Mycoplasma arter. Vi påviser og leser bakterie-DNA i pasientprøver med en metode som kalles direkte sekvensering. Tidligere kunne man bare tolke et funn av bakterie-DNA i prøver som inneholdt en enkelt bakterieart. Som de eneste i verden har vi utviklet og kommersialisert et databasert DNA-analyse verktøy (RipSeq) som gjør det mulig å tolke en blanding av DNA fra flere ulike bakterie arter. Dette er avgjørende i forhold til en lang rekke alvorlige infeksjoner som ofte forårsakes av mer enn en bakterie. Eksempler på dette kan være infeksjoner i hjernen, i leveren eller i lungehulen. Disse pasientene har ofte fått antibiotika før man får tatt de nødvendige prøver og tradisjonell diagnostikk som baserer seg på dyrkning av levende bakterier blir dermed svært upåliterlig og tidvis misvisende. Våre studier viser at ved alvorlige infeksjonstilstander der pasienten har fått antibiotika før prøvetaking bør direkte sekvensering alltid anvendes. Vi har sett på over 250 pasientprøver og vist en rekke ganger at sekvensering alene finner bakterier som har direkte konsekvenser for behandling av pasienten. I tillegg har vi vist for flere typer infeksjoner at disse er mer komplekse enn det man tidligere har anntatt basert på dyrkningssvar alene. Dette kan få konsekvenser for de generelle antibiotikaretningslinjene, det vil si den behandlingen man velger basert på erfaring før man har fått svar fra laboratoriet. Vi har også arbeidet med å optimalisere selve sekvenseringsprosessen. Vi har for eksempel vist at det for komplekse infeksjoner ikke er tilstrekkelig med en enkelt sekvenseringsreaksjon som skal finne alle bakterier, men at man heller bør fordele deteksjonen på ulike sekvenseringsreaksjoner. Når vi testet dette på et utvalg alvorlige blandingsinfeksjoner fant vi 80 % flere bakterietyper med den nye fremgangsmåten. Medisinsk mikrobiologi bør ha som mål å bli så pålitelig at svarene kan brukes til å skreddersy behandlingen for den enkelte pasient. Dette er viktig for å redusere antibiotikabruken og dermed faren for resistensutvikling, men også for å kunne redusere forkomsten av bivirkninger hos pasientene. Våre studier viser at tradisjonell dyrkningsbasert diagnostikk på langt nær er godt nok alene og at optimal bruk av DNA sekvenseringsutstyr som allerede finnes på de fleste universitetssykehus kan ta diagnostikken et langt og viktig skritt videre.

Påvisning av bakterier i pasientprøver ved DNA analysePåvisning av bakterie DNA i prøver fra pasienter med alvorlige infeksjoner gjør det mulig å identifisere bakterier uten å måtte dyrke dem i laboratoriet først. Vi har videreutviklet denne metodikken slik at den nå er nyttig hos langt flere pasienter enn tildigere.Tidligere kunne man rutinemessig bare tolke et funn av bakterie DNA i en prøve dersom prøven bare inneholdt en enkelt bakterieart. Som de eneste i verden har vi utviklet og kommersialisert et databasert DNA-analyse verktøy (RipSeq) som gjør det mulig å tolke også blanding av DNA fra flere ulike bakterier. DNAet leses først ved hjelp av DNA sekvensering, og resultatet fra DNA sekvenseringsprosessen tolkes deretter direkte ved hjelp av RipSeq. Dette er nyttig når man skal analysere prøver fra pasienter med typiske polybakterielle infeksjoner som hjerneabscesser eller infeksjoner i lungehulen. Disse pasientene har ofte fått antibiotika før man får tatt de nødvendige prøver og tradisjonell diagnostikk som baserer seg på dyrkning av levende bakterier blir dermed svært upåliterlig og tidvis misvisende. Selve prinisppet for dataverktøyet og reslutatene fra de første laboratorieforsøkene ble publisert i Journal of Clinical Microbiology i 2008. I år har vi fulgt opp med en studie av 250 pasientprøver fra ulike typer infeksjoner. Studien viste at sekvensering av polybakterielle infeksjoner etterfulgt av RipSeq analyse gav verdifull tilleggsinformasjon særlig hos pasienter som hadde fått en eller flere doser med antibiotika før prøven ble tatt og hos pasienter med anaerobe infeksjoner. Også denne artikkelen ble publiserte i Journal of Clincal Microbiology. Vi har også arbeidet med å optimalisere selve DNA sekvenseringsprosessen ved å definere og teste såkalte gruppespesifikke primere. Når man benytter 3 ulike primerpar som tilsammen dekker alle humanpatogene mikrober i stedet for ett enkelt universelt par kan man redusere problemer knyttet til ulike bakteriekonsentrasjoner og høyt antall ulike arter. Dette er i dag to av de største problemene i forbindelse med universell bakteriell amplifikasjon og sekvensering direkte fra humane kliniske prøver. På 20 prøver fra pasienter med alvorlige polybakterielle infeksjoner finner vi 50 % flere bakterier når vi bruker gruppe spesifikke primere i stedet for ett enkelt univerell primer par. Medisinsk mikrobiologi bør ha som mål å bli så påliterlig at svarene kan brukes til å skreddersy behandlingen for den enkelte pasient. Dette er viktig for å redusere antibiotikabruken og dermed faren for resistensutvikling, men også for å kunne redusere forkomsten av bivirkninger hos pasientene. Våre studier viser at tradisjonell dyrkningsbasert diagnostikk på langt nær er godt nok alene og at optimal bruk av DNA sekvenseringsutstyr som allrede finnes på de fleste universitetssykehus kan ta diagnostikken et langt og viktig skritt videre. I tillegg har vi optimalisert programmvaren for bruk til andre formål. I samarbeid med Univerity of Utah or ARUP laboratories (Utah, USA)skriver vi en artikkel som omhandler simultan amplifikasjon og sekvensering av 2 ulike gener i samme rør for identifikasjon av non-tuberkuløse mykobakterier. Ved å sekvenserer 2 ulike gener i stedet for et enkelt får man en sikrere identifikasjon, og RipSeq muliggjør dette langt raskere og mer konstnadseffektivt enn hva som har vært mulig tidligere.