Charactrisation of protein complexes in zebra fish models and brains from patients with Parkinson's Disease - Complementary funnctional analysis of neuronal death and development of clinical biomarkers of the disease

Mutasjoner i LRRK2 er den mest hyppige formen av familiœr Parkinson's sykdom. Ved å forstå funksjonen av LRRK2 vil man bedre kunne utføre screning av pasienter i forhold til kliniske observasjoner (for eksempel, ødem) men også bruke funnene videre for mulige intervesjonsstrategier.

Zebrafish represents an excellent model to study neurodegenerative disorders as it not only is very similar to humans genetically but also because of the easy of visualization of neurons and associated cells.

During the project period we have performed additional experiments on the zebrafish brain proteome including mapping of proteins that are targets for ubiquitination and SUMOylation. These proteins are expected to be regulated through protein degradation pathways. This study was published in Journal of neuroscience Research in 2013.

We also performed experiments related to the response of the zebrafish brain proteome when treated with oxidative stress, L-Dopa and Edaravone, a potent antioxidant and anti-inflammatory agent. We have successfully optimized the protein extraction methods and also the two-dimensional separation of the proteins. We have identified proteins that show variations in abundance in response to the different treatment regimes and these have been prepared for mass spectrometry for protein identification. We are currently performing the final analysis will be performed during the first 2 months of 2014. We expect to find proteins involved in oxidative stress responses and also in energy metabolism as we find these proteins in neuronal cell cultures. The latter has been submitted to BMC Neurobiology.

We have also developed zebrafish with reduced levels of LRRK2. We find that reduced LRRK2 results in neuronal loss and increased cell death with an accompanying increase in reactive oxygen species. We also find that kidneys express LRRK2 and that reduced levels of LRRK2 results in abnormalities in early kidney development. This manuscript will be submitted within 2 weeks from this report.

Zebrafish represents an excellent tool to study neurodegenerative diseases. This is mainly because of its genetic similarity to humans but also due to its ease of genetic manipulation and availability of protein analysis tools.

During the project period we have completed the analysis of the total zebrafish brain protein profile and identified a number of brain proteins. One of the identified proteins, SOD1, is critical for the reduction of oxidative stress. We performed SOD1 intracellular localization analysis and showed that SOD1 is expressed around neurons and particularly around the axons. We then showed that there is increased cell death around axons and the optic nerves. This manuscript has been submitted to the journal Experimental Brain Research.

We have also made good progress on identification of DJ-1 protein complexes in both neuroblastoma cell lines and in human brain samples. Using Blue-Naive gel electrophoresis and immunoprecipitation we have identified several DJ-1 interacting proteins and these are currently being analyzed further at the protein structure level through a collaborator in the UK.

Furthermore we have also used two dimensional gel electrophoresis to show a variety of DJ-1 isoforms at the subcellular level which are currently being analysed at a functional and structural level.

As an additional sideline we have also generated several other PD zebrafish models which are currently being submitted for publication.

Other publications

Mohammed Gebriel, Shubhangi Prabhudesai, Kai-Erik Uleberg, Eivind Larssen, Dominik Piston, Anne Hjelle Bjørnstad, and Simon Geir Møller (2013) The proteome of the zebrafish brain reveals proteins involved in oxidative stress protection. Exp. Brain Res. Submitted

Møller, Simon Geir. Local Lab Wins Grant In Hopes Of Uncovering Parkinson's Breakthrough. Interview on TV News Channel NY1, New York 07.08.2012

Møller, Simon Geir. Parkinsons Disease: Multiple approaches for a complex disorder. Doctoral Seminar series. New York. 24.09.2012

Møller, Simon Geir. Parkinsons Disease: Multiple approaches for a complex disorder. Orentreich Foundation for Science seminar series, New York. 20.11.2012

Møller, Simon Geir. Parkinsons Disease: Multiple approaches for a complex disorder. Graduate program in biological Sciences, New York. 16.10.2012

Møller, Simon Geir. Parkinson's Disease and new approaches. The Queens Chronicle, New York Newspaper 12.07.2012

Parkinson´s sykdom er en komplisert og sammensatt sykdom som er i hovedsak forårsaket av celledød i dopamine produserende nerveceller i hjernen. Hvordan og hvorfor disse nervecellene dør i pasienter med Parkinsons sykdom er enda uklart men mutasjoner i spesifikke gener spiller en viktig rolle. DJ-1/PARK7 er et protein som kan beskytte nerveceller gjennom å detoksifisere reaktive oxygen radikaler når cellene er utsatt for stress situasjoner. Mutasjoner i DJ-1/PARK7 genet forårsaker Parkinsons sykdom.

DJ-1/PARK7 proteinet finnes i de fleste celletyper i mennesker men hvordan DJ-1/PARK7 beskytter spesifikke nerveceller og hvorfor DJ-1/PARK7 mutasjoner kun har en effekt på nervecelledød er uvisst. Dette prosjektet har som mål å identifisere og karakterisere proteiner som interagerer med DJ-1/PARK7 i spesifikke deler av hjernen ved å bruke zebrafisk hjerner som en model og ved å bruke humant hjernevev. Vi tror at effekten og funksjonen av DJ-1/PARK7 i dopamine produserende nerveceller er tildels på grunn av interagerende proteiner men også tildels på grunn av modifikasjoner av DJ-1/PARK7 proteinet. Så langt i prosjektet har vi identifisert en rekke proteiner fra humant hjernevev som har en interaksjon med DJ-1/PARK7. Disse proteinene har blitt isolert gjennom protein-protein interaksjonestudier (blue-native elektroforese) og identifisert. Noen av de identifiserte proteinene er proteiner som finnes spesifikt i hjernevev og karakteriseringen av disse proteinene har blitt startet. Prosjektet har gjennom denne metoden konstrfuert forskjellige DJ-1/PARK7 protein komplekser. Prosjektet har også vist at en rekke metaller interagerer med DJ-1/PARK7 og at dette har en effekt på nervecelleoverlevelse. I tillegg til dette har prosjektet som mål å forstå hvordan DJ-1/PARK7 er involvert i prossesen som fjerner defekte mitokondrier fra celler. Denne delen av prosjektet har nylig startet, parallellt med prosjektets hovedmål, og har generert molekylære verktøy som skal inkorporeres i denne delen av analysen.

Prosjektet går som planlagt hvor en artikkel har blitt innsendt og hvor en rekke artikler vil bli sendt inn i løpet av 2012.

Parkinson’s sykdom (PD) er en neurodegenerativ sykdom som rammer ca 1 % av befolkningen over 65 års samt at hyppigheten øker med økt alder. Sykdommen kjennetegnes primært av bevegelsesforstyrrelser, men omtrent 30% av PD pasientene utvikler også tidlig demens. Pr idag finnes ingen kur mot Parkinsons sykdom samt at diagnostisering av sykdommen skjer som oftest veldig sent i forløpet. Hoved grunnen til dette er at årsaken til nervecelledød hos Parkinsons pasienter er ukjent.

Under oppstartsåret i 2010 har vi kunnet realisere nødvendige og viktige delmål for prosjektets framgang. Ved å bruke både humant hjernevev og hjernevev fra zebrafisk har vi kartlagt og identifisert mange proteiner som er potensielt viktige for utvikling og progression av Parkinsons sykdom. Vi har også vist at proteiner, som når defekte forårsaker Parkinsons sykom, danner store protein komplekser i hjerne celler. Arbeid har nå startet med å identifisere alle proteinene i disse protein kompleksene slik at disse kan analyseres i forhold til sykdomsforløpet. Vi har også dokumentert at en mengde proteiner er modifiserte i hjerne celler og vi har startet analyser som vil vise hvordan disse modifikasjonene forandrer seg i pasienter og zebrafisk med Parkinsons sykdom.

Gjennomføringen av prosjektet går etter planen og flere artikler er under planlegging i 2011.

Forskningsarbeidet er blitt utført ved forskningslaboratoriet ved Stavanger Universitetssjukehus og ved Centre for Organelle Research ved universitetet i Stavanger.