Role of Steroid Receptor Co-Activator SRC-2 in the Hepatocellular Response to Metformin

Prosjektnummer: 911692
Ansvarlig person: André Madsen
Institusjon: Helse Bergen HF
Prosjektkategori: Forskerutdanning - dr.grad
Helsekategori: Metabolic and Endocrine
Forskningsaktivitet: 1. Underpinning

2015 - sluttrapport

Livsstilsykdommen type 2 diabetes er kjennetegnet ved at muskler og sentrale organer får nedsatt følsomhet for hormonet insulin, også kjent som insulinresistens. En direkte konsekvens av insulinresistens er at insulinet mister evnen til å redusere leverens sukkerproduksjon samt fremme sukkeropptak i muskler og fettvev. Ved type 2 diabetes er legemiddelet metformin førstevalg ved medikamentell behandling. Metformin senker blodsukkeret primært ved å redusere leverens sukkerproduksjon og ved å fremme sukkeropptak i muskulatur. Til tross for at metformin har vært klinisk anvendt i stor skala i flere tiår, er de detaljerte virkningsmekanismene er fortsatt bare delvis kjent. Å kartlegge hvordan metformin bidrar til å normalisere blodsukkeret er viktig for å kunne utvikle nye medisiner for behandlingen av type 2 diabetes. I en separat artikkel i Diabetesforbundets fagtidsskrift "Diabetesforum" beskrev vi tidligere i år tematikken rundt hvordan metformin virker opp imot vår forskning. I vår nyeste publikasjon [1] har vi påvist en ny molekylærbiologisk mekanisme for hvordan metformin senker blodsukkeret og påvirker leverens stoffskifte. I artikkelen [1] viser vi at metformin nedregulerer genuttrykket av en faktor ved navn «Steroid Receptor Coactivator 2» (SRC-2) i leverceller. Tidligere studier på mus der SRC-2 er slått ut (knock-out musemodell) har vist at dyrene får lavt blodsukker under faste på grunn av manglende sukkerproduksjon i leveren. Vi bekrefter at SRC-2 er en viktig faktor som må være tilstede for å aktivere uttrykket av blant annet et gen (glukose-6-fosfatase, G6Pase), et sentralt enzym som avgjør leverens sukkerproduksjon. Dette dreier seg blant annet om en prosess som kalles gluko- (sukker) neo- (ny) genese (skapelse). Ved type 2 diabetes er det fra før kjent at glukoneogenesen er overaktiv og bidrar til et kronisk forhøyet blodsukker. I tillegg fant vi at metformin påvirker uttrykket av gener involvert i leverens fett- og kolesterolproduksjon via SRC-2. Vi konkluderer med at legemiddelet metformin delvis virker ved å nedregulere SRC-2, som igjen fører til nedsatt uttrykk av gener i leverens sukker- og lipidproduksjon. Vår andre nylige publikasjon [2] beskriver en ny mekanisme for hvordan hormonet glukagon, som aktiveres ved fasting, påvirker SRC-2 og genuttrykk av det sentrale enzymet (G6Pase) i leverens sukkerdannelse. Mekanismen for hvordan SRC-2 reguleres i cellen er beskrevet i detalj i egen artikkel [3]. FORSKNINGSPRODUKSJON VED AVSLUTTET PHD-PROSJEKT PER 30.12.2015: 3 PUBLISERTE ARTIKLER: [1] Madsen, A., Bozickovic, O., Bjune, J. I., Mellgren, G. & Sagen, J. V. Metformin inhibits hepatocellular glucose, lipid and cholesterol biosynthetic pathways by transcriptionally suppressing steroid receptor coactivator 2 (SRC-2). Scientific reports 5, 16430, doi:10.1038/srep16430 (2015). [2] Madsen, A., Bjune, J. I., Bjorkhaug, L., Mellgren, G. & Sagen, J. V. The cAMP-dependent protein kinase downregulates glucose-6-phosphatase expression through RORalpha and SRC-2 coactivator transcriptional activity. Molecular and cellular endocrinology 419, 92-101, doi:10.1016/j.mce.2015.10.003 (2016). [3] Hoang, T. et al. cAMP response element-binding protein interacts with and stimulates the proteasomal degradation of the nuclear receptor coactivator GRIP1. Endocrinology 154, 1513-1527, doi:10.1210/en.2012-2049 (2013). Vi har publisert en ny mekanisme for hvordan legemiddelet metformin, førstevalgs medikamentell behandling ved type 2 diabetes og brukt av anslagsvis 70000 nordmenn, virker på molekylæbiologisk nivå. Våre andre publikasjon finner en ny mekanisme for hvordan leverens blodsukkerdannelse reguleres, denne er altså over-aktiv ved diabetes. Forskningsarbeidet har beskrevet molekylærbiologiske mekanismer vedrørende diabetes sykdom og -behandling. Arbeidet har også ført til økt kompetanse ved Hormonlaboratoriet, Haukeland Universitetssykehus. Undertegnedes prøveforelesning samt disputas for PhD-graden fant sted og ble godkjent 18.12.2015 ved Bygg for Biologiske Basalfag, Universitetet i Bergen.

2014

Nye mekanismer for verdens mest anvendte diabetesmedisin og type 2 diabetes.Type 2 diabetes er en livsstilssykdom som er i ferd med å bli en folkesykdom. Metformin står i første rekke av medikamentell behandling av denne sykdommen, men virkningsmekanismene er fortsatt lite kartlagt. Vår forskning kan tyde på at metformin delvis virker ved å hemme funksjonen av SRC-2, en faktor som påvirker reguleringen av flere gener.Hormonene insulin og glukagon er signalmolekyler i blodet, og begge er med på å opprettholde et stabilt blodsukkernivå. Hver for seg har disse hormonene omvendte effekter på glukosestoffskiftet i kroppen. Mens insulin senker blodsukker etter matinntak, har glukagon motsatt effekt ved faste. Disse hormonene regulerer blant annet leverens sukkerproduksjon, som er en betydelig kilde til blodsukker under faste. Leveren er i praksis et gjenoppladbart batteri der sukker lagres i form av glykogen etter et måltid, men dette lageret kan mobiliseres i fravær av matinntak ved en prosess kjent som glykogenolysen. Ved fasting utover noen timer fremmer bl.a. glukagon en prosess kalt glukoneogenesen der glukose syntetiseres fra laktat (melkesyre), glyserol eller enkelte aminosyrer. Slik utvides tidsvinduet der leveren kan frigjøre glukose og opprettholde blodsukkernivået. Insulin derimot, hemmer glukoneogenesen ved å slå av genuttrykk av sentrale enzymer som driver denne metabolske prosessen. Type 2 diabetes er imidlertid karakterisert av insulinresistens; cellene responderer ikke til insulin. Når denne «insulin-bremsepedalen» ikke fungerer, vil leveren produsere sukker til blodomløpet kontinuerlig. Dette er den viktigste mekanismen for hvordan insulinresistens i type 2 diabetes bidrar til kronisk forhøyet fasteblodsukker, også kalt hyperglykemi. I en pågående studie har vi fokusert på genet SRC-2, som har en kjent funksjon med hensyn til å koordinere cellers respons til ulike hormoner. SRC-2 er i litteraturen kjent å fremme leverens sukkerproduksjon ved å fremme uttrykk av enzymet glukose-6-fosfatease (G6Pase) som katalyserer det siste trinnet i så vel glykogenolysen og glukoneogenesen der glukose-6-fosfat omdannes til glukose. Fra forsøk med levercellelinjer har vi observert at genuttrykket og aktiviteten av SRC-2 ble kraftig senket ved behandling med metformin. Forsøk tyder på at leverens glukose- og lipidmetabolismen påvirkes av metformin blant annet via SRC-2.

2013

Hormonell regulering av leverens sukkerproduksjonDiabetes mellitus type 2 (T2D) er en utbredt sykdom som skyldes for lite insulin og redusert insulinfølsomhet. I det bukspyttkjertelen ikke klarer å imøtekomme insulinbehovet begynner blodsukkeret å stige. Metformin er førstevalg ved medikamentell behandling av T2D, og det reduserer leverens sukkerproduksjon samt øker perifer insulinfølsomhet.I dette prosjektet er vi spesielt interessert i proteinet SRC-2 som tilhører Steroid Receptor Coactivator (SRC) familien (SRC-1, SRC-2 og SRC-3). Dette proteinet deltar i reguleringen av genuttrykket og har en sentral rolle i energiomsetning og metabolisme. I dette prosjektet studerer vi spesielt hvilke funksjoner SRC-2 har på omsetningen av glukose i lever. I tillegg er vi interessert i å se nærmere hvordan SRC-2 reguleres av ulike signalveier. Delprosjekt 1: Ved hjelp av studier i levercellelinjer studerer vi hvordan to ulike signalveier (cAMP/protein kinase A (PKA) og AMPK veien) påvirker reguleringen av G6Pase, det siste trinnet i leverens glukoseproduksjon, via SRC-2. Metformin er kjent å redusere uttrykket av G6Pase, men våre studier tyder på at dette ikke skjer via SRC-2. Vi har imidlertid funnet at uttalt stimulering av cAMP/PKA signalveien reduserer uttrykket av G6Pase, og dette synes å gå via SRC-2. Våre funn kan muligens forklare noe av det som skjer ved langtids faste der leverens sukkerproduksjon nedreguleres. Delprosjekt 2: Med bakgrunn i funn at stimulering av AMPK signalveien ved hjelp av metformin eller AICAR påvirker SRC-2 uttrykket ønsker vi å undersøke hva dette betyr for det globale genuttrykket. En levercellelinje er blitt behandlet med metformin, og endringer i det globale genuttrykket er blitt undersøkt med mikromatrise. Disse dataene blir nå sammenstilt med resultater fra ChIP-sequencing der vi undersøker hvordan metformin påvirker SRC-2 sin tilstedeværelse på ulike promoterregioner. Funnene vil bli sammenholdt med funksjonelle endringer som cellulært opptak og omsetning av glukose.

2012

Hormonell regulering av leverens sukkerdannelseNormalt blodsukker opprettholdes ved at hormonene insulin og glukagon henholdsvis senker eller øker leverens glukoseproduksjon. Ved type 2 diabetes er leverens glukoseproduksjon forhøyet og bidrar til økt blodsukker. Vi studerer hvordan hormoner regulerer genuttrykk og forandrer metabolismen i leverceller.Sukkerproduksjonen i leveren er underlagt enzymer som styrer ulike steg i dannelsen av glukose som til slutt skilles ut i blodet. Denne prosessen reguleres kontinuerlig via hormoner som aktiverer komplekse signaliseringssystemer og dermed påvirker genuttrykket av de aktuelle enzymene i hver enkelt levercelle. Hormonet glukagon fremmer leverens glukoseproduksjon ved å stimulere transkripsjon av blant annet nøkkelenzymet glukose-6-fosfatase (G6Pase) via aktivering av Protein Kinase A (PKA) signalveien. Selv om leveren bidrar med nødvendig glukose til resten av kroppen under faste, er kronisk forhøyet blodsukker over lengre tid skadelig. Det blodsukker-senkende legemiddelet metformin er førstevalg ved medikamentell behandling av type 2 diabetes. Det er imidlertid stor uvisshet om de basale mekanismene for hvordan metformin reduserer sukkerproduksjonen fra leverceller. Hovedfokus på doktorgradsavhandlingen er rettet mot hormonell regulering av proteiner som tilhører samme familie transkripsjonsfaktorer, nemlig koaktivatorfamilien Steroid Receptor Coactivator (SRCs). Foreliggende data har vist at SRC-2 er viktig for genuttrykking av G6Pase, og denne aktiviteten er underlagt regulering av glukagon og PKA-signalveien. Vi har brukt leverceller som modell for å undersøke hvordan kjernereseptoren RORa, samt dens koraktivator SRC-2, i denne sammenhengen blir regulert, siden disse to faktorene er sentrale i genreguleringen av G6Pase. Foreløpige data kan tyde på at ikke metformin, men PKA-signalveien ved ekstrem aktivitet eller over tid nedregulerer RORa/SRC-2 med henhold til genuttrykking av G6Pase. Vi tror derfor at den markante nedgangen i leverens glukoseproduksjon etter lengre tids faste eller sult kan relateres til PKA-avhengig nedregulering av RORa/SRC-2. Vi holder for tiden på med molekylærbiologiske forsøk der vi ser på hvordan binding av RORa/SRC-2 til G6Pase genet, et nødvendig steg i prosessen av genuttrykking, forandrer seg i respons til PKA-signalisering for å etterprøve denne hypotesen.

2011

Studier av regulering av adipogenese og metabolisme i fettvevHormonell regulering inngår i utviklingen (differensiering) av nye fettceller. Klassiske steroidhormoner virker ved å aktivere kjernereceptorer i målceller, som i respons tilpasser sitt genuttrykk. Vi har fattet interesse for et spesielt protein (steroid receptor coactivator 2; SRC-2), som i mennesker modulerer aktivitet av kjernereceptorer.Ettersom molekylærbiologi handler om å utforske biologiske mekanismer på/under cellenivå, er det å ha en passende cellemodell som kan utføres praktiske og målbare forsøk på, av uvurderlig betydning. Vi har derfor, i samsvar med norsk lovgivning, inngått samarbeid med en privat klinikk i Bergen som utfører fedmeoperasjoner. Ved fettsuging av pasienter avhentes utsugd fettvev, og herfra isoleres celler som har potensiale til å bli fettceller (såkalte pre-adipocytter). Disse cellene dyrkes frem, og selve differensieringen av fettcellene er gjenstand for forskning. Vi har med dette en ypperlig cellemodell med den styrke at den er relatert til menneskelig fysiologi. Konvensjonelle fettcelle-kulturer stammer fra rotter eller mus, og data fra forsøk med slike celler har ikke like stor grad av overførbarhet til menneskelig cellebiologi. Vi benytter denne cellemodellen til å utføre ulike typer eksperimenter designet for å videre kartlegge funksjonen av SRC-2 i fettceller. Vi utfører kvantitative genuttrykksanalyser (qPCR) i kombinasjon med celleforsøk der genet for SRC-2 «slås av» ved en prosedyre kalt siRNA knock-down. Ved å hemme uttrykking av SRC-2 vil vi analysere hvordan SRC-2 påvirker fettcelleutviklingen, og for øvrig hvordan SRC-2 regulerer genuttrykk og metabolisme i modne menneskelige fettceller. Optimalisering av slike forsøk er for øyeblikket hovedfokus. Preliminære data tyder også på protein-interaksjoner mellom SRC-2 og andre proteiner og enzymer som er av høy relevans for metabolisme; dette vil undersøkes nærmere med dertil egnete metoder. Hittil i arbeidet med doktorgraden har undertegnede som tredjeforfatter også vært engasjert i praktisk laboratoriearbeid relatert til en kommende publikasjon om hvordan SRC-2 selv blir regulert av signalveier og andre proteiner i cellen. Manuskriptet til denne publikasjonen er sendt inn til journalen Nucleic Acids Research for vurdering.

Vitenskapelige artikler

Madsen A, Bozickovic O, Bjune JI, Mellgren G, Sagen JV

Metformin inhibits hepatocellular glucose, lipid and cholesterol biosynthetic pathways by transcriptionally suppressing steroid receptor coactivator 2 (SRC-2).

Sci Rep 2015;5():16430. Epub 2015 nov 9

PMID: 26548416

Hoang Tuyen, Fenne Ingvild S, Madsen Andre, Bozickovic Olivera, Johannessen Mona, Bergsvåg Mari, Lien Ernst Asbjørn, Stallcup Michael R, Sagen Jørn V, Moens Ugo, Mellgren Gunnar

cAMP response element-binding protein interacts with and stimulates the proteasomal degradation of the nuclear receptor coactivator GRIP1.

Endocrinology 2013 Apr;154(4):1513-27. Epub 2013 mar 5

PMID: 23462962 - Inngår i doktorgradsavhandlingen

Hoang, T.

cAMP response element-binding protein

Endocrinology, 2013

Madsen, A.

The cAMP-dependent protein kinase downregulates glucose-6-phosphatase expression through RORalpha

Mol Cell Endocrinol, 2015

Doktorgrader

André Madsen

Function and regulation of Steroid Receptor Coactivator 2

Disputert:: desember 2015
Hovedveileder:: Jørn V. Sagen

Deltagere

Andre Greger Madsen PhD-kandidat
Gunnar Mellgren Medveileder
Jørn V. Sagen Hovedveileder

eRapport er utarbeidet av Sølvi Lerfald og Reidar Thorstensen, Regionalt kompetansesenter for klinisk forskning, Helse Vest RHF, og videreutvikles av de fire RHF-ene i fellesskap, med støtte fra Helse Vest IKT

Alle henvendelser rettes til Faglig rapportering, Helse Vest