Identifisering av enzymer som regulerer kroppens metabolisme via hormonregulering

HOVEDMÅL Sammendrag: Prosjektets hovedmål var å identifisere et eller flere N-terminal acetyltransferaser som er involvert i modifiseringen av peptid hormonene alfa-MSH og beta-endorfin. Ved hjelp av bisubstratanalogene nevnt i tidligere rapporter samt massespektrometriske analyser kom vi et skritt nærmere identifiseringen, men på grunn av tidsbegrensningen fikk vi ikke optimalisert metodene nok til at vi kan si med sikkerhet hvilke enzymer som acetylerer peptid hormonene. Derimot klarte vi å snevre inn antallet kandidater ved hjelp av lokaliseringsstudier med fluoresensmikroskopi samt å utvikle spesifikke antistoffer mot flere av kandidatene. I tillegg ble det generert cellelinjer hvor genet for de ulike kandidatene var individuelt slettet fra genomet ved hjelp av Crispr/Cas9 metoden. Disse cellelinjene ble blant annet brukt til testing av de spesifikke antistoffene mot kandidatene, men også testingen av antistoffene mot acetylert og uacetylert alfa-MSH og beta-endorfin. Vi testet også kandidatenzymene i ulike aktivitetsforsøk etter at de var blitt renset fra humane og musecellelinjer hvor de var blitt overuttrykt, men dette ga ingen positive utslag og metodene må optimaliseres videre. Ved hjelp av bisubstratanaloger har vi forsøkt å isolere enzymet/-ene fra ulike typer cellepreparater. Det gjenstår fremdeles å optimalisere metodene for denne delen av prosjektet. Dette inkluderer de massespektrometriske analysene som inngår (nytt instrument ble installert kort tid før prosjektet ble avsluttet). DELMÅL Sammendrag: Prosjektets to delmål var å studere enzymene i forhold til deres molekylære mekanismer, regulering og biologiske påvirkning samt å utvikle aktiverende/hemmende molekyler for enzymenes aktivitet. Begge delmålene ble adressert i løpet av perioden, men heller ikke her er resultatene klare. Noen av kandidatproteinene skiller seg mer ut som svært potensielle NAT enzymer med aktivitet mot enten alfa-MSH eller beta-endorfin. På grunn av dette ble planleggingen av NAT-hemmere startet i prosjektets sluttfase. Identifiseringen av NAT enzymet/-ene som acetylerer alfa-MSH og/eller beta-endorfin vil gi oss et viktig innblikk i hvordan kroppen styrer pigmentering, smerte og seksuell drift, reduserer inflammasjon og appetitt, samt øker regenereringen av nevroner og kroppens energiforbruk. Dette vil kunne komme til nytte for pasienter med en rekke ulike sykdommer når videre studier har belyst dette ytterligere.