Kliniske og molekylære effekter av guanylat syklase-aktivering

Kliniske og molekylære effekter av guanylat syklase c- aktivering.I 2015 utarbeidet jeg manuskript til en min andre artikkel som vil inngå i doktorgraden og er godt i gang med artikkel nummer 3. Jeg har deltatt i ytterligere 3 vitenskapelige publikasjoner, presentert 2 av delprosjektene som postere på internasjonale og nasjonale konferanser og fullført den obligatoriske opplæringsdelen av phd-programmet.Doktorgradsprosjektet tar utgangspunkt i en ny sykdom, Familiært GUCY2C diare syndrom (FGDS). I 2012 publiserte vi i New England Journal of Medicine en karakteristikk og den genetiske årsaken til FGDS. Min rolle i denne publikasjonen var klinisk karakterisering av 32 pasienter med arvelig diare, noe som gav meg delt annenforfatterskap og den første vitenskapelige artikkelen som vil inngå i doktorgraden. FGDS skyldes en aktiverende mutasjon i genet som koder for den enzymkoblede reseptoren guanylat syklase C. Sykdommen kjennetegnes av tidlig debuterende kronisk moderat diare, men et annet viktig funn var at om lag 20 % av pasientene også hadde utviklet Crohn´s sykdom. Prosjektet har som hovedfokus å undersøke faktorer som kan ha betydning for å utvikle denne inflammatoriske tarmsykdommen. I korte trekk inngår 5 delprosjekter: 1) Vevsprøver fra terminale ileum hos pasienter med FGDS, friske kontroller og ubeslektede pasienter med Crohn´s sykdom er undersøkt for globalt gen-uttrykk med mikromatriser. Jeg har analysert data med ulike bioinformatiske verktøy og verfisert funn med kvantitativ PCR. FGDS pasientene har nedregulert metallothioneiner, proteiner som har viktige funksjoner knyttet til regulering av oksidativt stress og fjerning av bakterier fra slimhinne. 2) Gene set enrichment analyse (GSEA) av et sett med gener knyttet til guanylat syklase C- signalveien er gjennomført i store genomvide pasient-kontroll datamaterialer for de to inflammatoriske tarmsykdommene Crohn´s sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC). Jeg har gjennomført kurering av genliste og GSEA. En liste av guanylat syklase C- gener er signifikant assosiert med CD. 3) Genetiske risikovarianter for inflammatorisk tarmsykdom ble kartlagt hos 22 pasienter med FGDS ved bruk av mikromatrise og Sangersekvensering. Vi finner en nær korrelasjon mellom genetiske varianter av NOD2 genet og CD i FGDS gruppen. NOD2 som har en sentral rolle i sykdomsmekanismene til CD, gjenkjenner bakteriemønstre og engasjerer metallothioneiner i fjerning av bakterier. 4)Tarmbakteriene ble undersøkt med gensekvensering i avføringsprøver hvor vi fant store forskjeller mellom FGDS og friske kontroller. Et viktig funn var lav forekomst av faecalibacterium prausnitzii, noe som er godt kjent fra pasienter med CD og UC. Funnet er interessante her fordi de knyttes til risiko for Crohns sykdom og til en spesifikk signalvei. 5) Videre klinisk oppfølging av pasienter med FGDS er blitt integrert med overlege Hilde von Volkmann sitt phD prosjekt ”GUCY2C genotyper – Intestinal inflammasjon og dysmotilitet – en link til Crohns sykdom?”. I tillegg til årlige kontroller har FGDS pasientene fått konsultasjoner etter behov. I 2015 har jeg arbeidet med 2 manuskript, det største sammenfatter funnene i delprosjekt 2,3 og 4. Manuskriptet er til revisjon hos hovedveileder før utsendelse til medforfattere. Manuskript til artikkel 3 om tarmmikrobiomet ved FGDS er godt i gang. Jeg presenterte forskningsfunnene mine på 3 internasjonale og nasjonale konferanser i 2015. I tillegg var jeg medforfatter på ytterligere 3 vitenskapelige artikler, 2 som er til review og 1 som ble antatt 17.01.15, "Colonic mucosal epigenetic and metagenomic development in children and adolescents" i J Immunol Res. Jeg har gjennomgått 2 nettbaserte kurs i statistikk og har dermed fullført den obligatoriske opplæringsdelen. Helse-Vest stipendet er blitt utvidet med 6 måneder til 21.08.16.

Clinical and Molecular effects of Guanylate Cyclase-C activation« Familial Diarrhea Syndrome caused by an Activating GUCY2C-mutation» ble publisert i New England Journal of Medicine i 2012. I mitt prosjekt studerer jeg mulige årsaker til pasientene sin økte risiko for inflammatorisk tarmsykdom, ved å undersøke andre genetiske risikovarianter, genuttrykk i tynntarmen og tarmbakteriefloraen hos de affiserte.Fokus for ph.D-arbeidet er å utforske årsaker til den høye risiko for Crohns sykdom som man ser ved Familiært GUCY2C-diare-syndrom(FGDS). Ved Genomics Core Facility, Universitetet i Bergen ble det våren 2014 gjort global genekspresjonsanalyse av tynntarmsbiopsimateriale fra 11 FGDS-pasienter, 16 kontroller og en rekke pasienter med andre tarmsykdommer. Jeg analyserte og tolket disse dataene ved hjelp av ulike pathway-analyse-metoder (Gene Set Enrichment Analysis, DAVID Functional Annotation Cluster Analysis og Ingenuity/IPA). Vi fant at pasientene med FGDS har lavere uttrykk i distale del av tynntarmen av ni gener som tilhører gruppen metallothioneiner. Metallothioneiner har kjente roller i forsvaret mot Crohn's sykdom, bla ved å være sentrale i den inflammasjonshemmende autofagiprosessen. Undersøkelser av alle kjente genetiske lavrisikovarianter hos pasientene med FGDS ved hjelp av mikromatriseanalyse viste at 6 av de 7 FGDS-pasientene med Crohns sykdom har en eller to lavrisikovarianter i NOD2-genet, det mest kjente risikogen for Crohn's sykdom. De FGDS-pasientene som er hardest rammet av Crohn's sykdom har to risikovarianter i NOD2 (de er homozygote) . Av FGDS-pasientene uten Crohns sykdom har kun 3 av disse risikovarianter i NOD2-genet (de er heterozygote). Autofagi-responsen som beskytter mot tarmbakterieutløst inflammasjon startes ved at NOD2 eller andre pattern-recognition-reseptorer stimuleres av bakterie-bestanddeler. Jeg arbeider med et utkast til artikkel om genuttrykk i tarmslimhinne og NOD2-risiko-variantene. Dataene vil presenteres som poster ved den 10ende European Crohns & Colitis Organization-konferansen i Barcelona 18.-21- februar 2015. I samarbeid med overlege Hilde Von Volkmann og dr. Kim Nylund, begge Medisinsk Gastro-avdeling , Helse-Bergen har vi undersøkt 26 pasienter med FGDS klinisk , biokjemisk og ultrasonografisk. I forhold til den opprinnelige karakteriseringen identifiserer vi 4 nye pasienter med tilstanden og et økt antall alvorlige manifestasjoner (nyfødt-dehydering, tynntarmskirurgi). Dr. Von Vollkmann finner også motilitetsforandringer i tynntarm, funn som vil presenteres muntlig på internasjonal ultralyds-konferanse i Florida senvinter 2015. Gjennom 2013 ble det samlet avføring fra pasientene med FGDS og deres friske husholdningsmedlemmer. Disse prøvene ble analysert med sekvensering av 16S ribosomalt RNA ved Oslo Universitetsykehus , Norsk senter For Primær Scleroserende Cholangitt september 2014. Da prøvene inngikk i et større prosjekt hadde vi også kontrollprøver fra en rekke ikke-relaterte friske personer og pasienter med andre tarmsykdommer. Vi finner at pasienter med FGDS har en særegen tarmbakterie-profil som er kjennetegnet ved nær fravær av bifidobakterier, lave faecalibacterium prausnitzi og store mengder cyanobakterier og archae. De 2 førstnevnte har kjente beskyttende roller mot inflammasjon. I samarbeid med kolleger i Helse-Bergen og ved Rikshospitalet vil jeg i skrive om tarmbakterie-karakteristika ved FGDS, den planlagt 3. og siste som inngår i mit doktorgradsarbeide.

Sammendrag forskningsprosjekt 911763 « Clinical and molecular effects of guanylate cyclase C-activation»Forskningsprosjektet kretser rundt en arvelig tarmsykdom som for første gang ble karakterisert og navngitt i 2012 av forskere i Helse-Bergen og Indian Institute of Science. Sykdommen er hittil kun kjent hos 32 personer i samme slekt, de fleste bosatt på Vestlandet. Fokus for prosjektet er å utforske mekanismer som fører til tarminflammasjon.« Familial Diarrhea Syndrome caused by an Activating GUCY2C-mutation» ble publisert New England Journal of Medicine i 2012. Torunn Fiskerstrand var førsteforfatter av artikkelen, med meg som delt annen-forfatter. Artikkelen beskriver en "ny" tarmsykdom, den genetiske årsaken, molekylære effekter og kliniske manifestasjoner. Tilstanden kalt Familiært GUCY2C-diaresyndrom (FGDS) , skyldes en aktiverende mutasjon av genet for guanylat syklase C. Hovedfokus for mitt doktorgradsarbeide er å utforske årsaken til den høye forekomst av Crohn’s sykdom hos pasienter med FGDS og hvorvidt aktivering av guanylat syklase C er involvert i sykdomsmekanismen for inflammatoriske tarmsykdommer. Publikasjoner 2013:«Familiært GUCY2C diaresyndrom- mye å lære av en sjelden sykdom» «BestPractiseGastroenterologi» nr 5, november 2013. (Ikke Pub.Med-registrert). BMED 903 Laboratoriekurs i Farmakologisk forskningsmetodikk (-- poeng). MEDMET1 / Grunnkurs i medisinsk og helsefagleg forsking (8 poeng) 1) Signalveisanalyse av guanylat sykslase C på pasienter med Crohn’s sykdom. Første halvdel av 2013 laget jeg en liste over 104 gener som inngår i guanylat-syklase signalveien. Vi undersøkte om denne signalveien er overrepresentert i genomvide assosiasjons-studier (GWAS) for Crohn’s sykdom. Vår institusjon har erfaring signalveisanalyser gjort innenfor psykiatri-feltet, med metoden Gene-Set Enrichment Analysis (GSEA). Vi utførte GSEA på GWAS-data gjort tilgjengelige av våre samarbeidspartnere i Oslo og i Kiel. Det ble ikke funnet statistisk overbevisende holdepunkt for at genvarianter i guanylat syklase C-signalveien er overrepresentert hos personer med Crohn’s sykdom. En svensk forskergruppe vil benytte min gen-liste for å gjøre den samme type analyse hos pasienter med irritabel tarm-sykdom. 2) Forekomst av Crohn’s sykdom risiko-gen hos pasienter med Familiært GUCY2C-diare-syndrom. Pasientene med FGDS fikk i 2013 analysert forekomst av kjente risikovarianter for Crohn's sykdom. Vi arbeider med endelig å verifisere en svært nær korrelasjon mellom Crohn’s sykdom risikogen og manifestasjon av Crohn’s sykdom hos pasienter med FGDS. Et utkast til artikkel om disse funnene er skrevet. 3) Tarmbakterier ved familiært GUCY2C-diare-syndrom. FGDS gir økt utskillelse både av væske, salter og bikarbonat til tarmen, noe som antas å påvirke vekstforhold for tarmbakteriene. Vi undersøker tarmfloraen ved FGDS og hvorvidt denne kan ha betydning for utvikling av Crohn’s sykdom. Prøvene vil bli analysert basert på bakteriegenetikk i første halvdel av 2014 ved Oslo Universitetssykehus. 4) Gener uttrykt i tarmslimhinnen til pasienter med FGDS. Tarmbiopsier fra pasienter med FGDS undersøkes for gen-uttrykk ved hjelp av mikromatrise-metode, med mål om å utforske biologiske konsekvenser av guanylat- syklase aktivering. Undersøkelsene gjøres på Genomics Core Facility ved UiB. Vi vil ha data løpet av vinteren 2014. Delprosjekt 5) Klinisk oppfølging av pasienter med FGDS. Vi har startet systematisk klinisk og biokjemisk oppfølging av pasienter med FGDS. Overlege Hilde von Volkmann og dr. med Kim Nylund fra Gastroenterologisk seksjon har fra 2014 HelseVest midler for å gjennomføre dette prosjektet som også omfatter ultralyd-undersøkelser av tarm, knyttet til Nasjonalt Senter for Gastroenterologisk Ultrasonografi. Prosjektet er planlagt å løpe over 2-3 år.