Guanylat syklase C aktivering – betydning for utvikling av kronisk diare og inflammasjon i tarmen

Guanylat syklase C aktivering - betydning for utvikling av kronisk diare og inflammasjon i tarmenVi studerer effektene av en aktiverende genfeil i guanylat syklase C hos pasienter med familiært GUCY2C diaresyndrom. Pasientene har kronisk diare med øket risiko bl.a for Crohn's sykdom. Et hovedmål har vært å etablere en knock-in musemodell av genfeilen. Vi utfører kliniske, molekylære og radiologiske studier av tarmen hos pasienter og kontrollerProsjektet har sitt utgangspunkt i vår kliniske og molekylære karakterisering av en ny arvelig sykdom i en norsk familie - familiært GUCY2C diaresyndrom (FGDS). De affiserte (n=32) har kronisk diare og en IBS-lignende tilstand, med øket risiko for mer alvorlige sykdommer i tarmen som inflammasjon (20 % har Crohn's sykdom) og tarmobstruksjon. FGDS skyldes en aktiverende genfeil i GUCY2C genet som koder for guanylat syklase C (GCC) - tarmens reseptor for E.coli toksin og guanylinhormoner. En aktivering av denne reseptoren fører til øket utskillelse av NaCl til tarmen. Våre studier viser betydningen av GCC-signalomforming for normal tarmfunksjon, og vi er spesielt interessert i å finne ut hvorfor aktivering gir øket risiko for tarmbetennelse. Punktene 2-3ab og 3c-4 nedenfor utgjør henholdsvis Rune Rose Tronstad og Hilde Von Volkmann sine doktorgradsarbeid. 1. Vi har utviklet en transgen musemodell som uttrykker den aktiverende genfeilen. I oktober 2015 ble dyrene sendt til vår samarbeidspartner professor S.S. Viswesvariah, som nå er i gang med den fenotypiske karakteriseringen av dyrene. 2. Ved datamining av et stort tilgjengelig GWAS materiale (>6000 pasienter med Crohn's sykdom og 15000 kontroller) fant vi at GCC-signalveien var signifikant assosiert med Crohn's sykdom. Dette er svært interessant og peker spesielt på betydningen av ionekanaler/transportere for inflammasjonsprosessen i tarm. 3. Vi har gjort flere biologiske funn hos pasientene med FGDS (de fleste har helt normal tarmslimhinne) som ligner de man ser ved manifest Crohn's sykdom. Det er derfor mulig at disse funnene peker på endringer som predisponerer for inflammasjon: a) Studier av genuttrykk i frisk tynntarm hos FGDS-pasientene viste signifikant nedregulering av 9 metallothioneiner sammenlignet med kontroller. Disse proteinene binder sink og er nødvendige for NOD2-stimulert autofagi av bakterier, som er en sentral prosess i patogenesen ved Crohn's sykdom. FGDS pasienter som har utviklet Crohn's sykdom skilte seg fra de uten denne sykdommen ved en mye høyere andel lavrisikovarianter i NOD2 genet. b) Analyse av tarmbakteriefloraen hos 24 FGDS-pasienter viste signifikant lavere nivåer av bifidobakterier og faecalibacterium prausnitzi sammenlignet med friske kontroller. Dette er to arter som begge har en beskyttende effekt mot inflammasjon og som også finnes i lavere mengde hos pasienter med standard Crohn's sykdom. c) Plasmanivå av begge guanyliner (fastende) var signifikant lavere hos FGDS pasienter og pasienter med standard Crohn's sykdom (i remisjon), sammenlignet med kontroller. Immunhistokjemi viste øket mengde guanylin i endokrine celler ved FGDS. Det er mulig at inflammasjonsdrivende prosesser har en negativ feedback på utskillelse av guanyliner fra endokrine celler, noe som vil bremse flux gjennom GCC-signalveien. 4. Ved ultralydundersøkelser påviste vi unormal mengde væske og svekket kontraksjonsevne i tynntarmen hos FGDS pasienter, i fastende tilstand. I 2015 startet Von Volkmann et større prosjekt hvor tynntarmsmotilitet og nivået i plasma av ulike hormoner hos FGDS pasienter og friske kontroller undersøkes før og 30 min, 1, 2 og 4 timer etter et måltid. Pasientene svelger også en liten kapsel like etter inntak av måltidet som kontinuerlig registrerer pH, trykk og temperatur gjennom hele mage-tarmkanalen. Preliminære data viser svært interessante sammenhenger mellom væskemengde, tarmmotorikk og transittid gjennom tarmen, sammenholdt med hormonnivåer.

Guanylat syklase C aktivering - betydning for utvikling av kronisk diare og inflammasjon i tarmenVi studerer effektene av en aktiverende genfeil i guanylat syklase C hos pasienter med familiært GUCY2C diaresyndrom. Pasientene har kronisk diare med øket risiko bl.a for Crohn's sykdom. Et hovedmål er å etablere en knock-in musemodell av genfeilen. Vi utfører også kliniske, molekylære og radiologiske studier av tarmen hos pasienter og kontrollerProsjektet har sitt utgangspunkt i vår kliniske og molekylære karakterisering av en ny arvelig sykdom i en norsk familie - familiært GUCY2C diaresyndrom (FGDS). De affiserte har kronisk diare og en IBS-lignende tilstand, med øket risiko for mer alvorlige sykdommer i tarmen som inflammasjon (Crohn's sykdom) og tarmobstruksjon. FGDS skyldes en aktiverende genfeil i GUCY2C-genet som koder for guanylat syklase C - tarmens reseptor for E.coli toksin og guanylinhormoner. Våre studier viser betydningen av guanylat syklase C signalomforming for normal tarmfunksjon, og vi er spesielt interessert i å finne ut hvorfor aktivering gir øket risiko for tarmbetennelse. Et hovedmål for prosjektet er å utvikle en transgen musemodell som uttrykker den aktiverende genfeilen, et arbeid som startet i desember 2013. I mars 2015 skal dyrene leveres til oss. Vår samarbeidspartner professor Sandhya S. Viswesvariah vil gjøre den fenotypiske karakteriseringen og gjennomføre dyreforsøkene, mens de molekylære og biokjemiske analysene i stor grad vil foregå ved Senter for medisinsk genetikk og molekylærmedisin. I løpet av 2014 har stipendiat Rune Rose Tronstad gjort ferdig det eksperimentelle arbeidet for sin doktorgrad, og er i gang med å skrive de to siste artiklene som skal inngå i denne. I februar 2014 startet også Hilde Von Volkmann som stipendiat, og hun undersøker faktorer som påvirker motilitet og innhold i tarmen hos FGDS-pasienter. Funn så langt viser øket væskespeil i tynntarmen under faste (uvanlig), kombinert med ineffektive tarmkontraksjoner. Tronstad har studert genuttrykket i normal slimhinne fra tynntarmen hos 11 FGDS-pasienter sammenlignet med data fra 6 pasienter med "vanlig" Crohn's sykdom og 16 normale kontroller. Han fant signifikant nedregulering av 9 gener som koder for metallothioneiner hos FGDS-pasienter. Metallothioneiner binder sink og er nødvendige for NOD2-stimulert autofagi av bakterier, som igjen er implisert i patogenesen ved Crohn's sykdom. Tronstads data fra matriseundersøkelser av alle kjente lavrisikovarianter for Crohn's sykdom peker også i retning av forstyrret NOD2-funksjon, da 6 av 7 FGDS-pasienter med Crohn's sykdom har minst en risikovariant i dette genet (de mest alvorlig affiserte har to), mens andelen er 3 av 17 for FGDS pasienter uten Crohn's sykdom. Tarmslimhinnen er i nær interaksjon med tarmbakteriene, og disse påvirker i mange tilfeller biokjemiske prosesser hos verten. Tronstad har også analysert tarmbakteriefloraen hos 24 FGDS-pasienter, 12 friske familiemedlemmer, og andre kontrollgrupper. Resultatene viste signifikant meget lavt nivå av bifidobakterier og lav mengde faecalibactrium prausnitzi, to arter som begge har en beskyttende effekt mot inflammasjon. Bifidobakterier livnærer seg på muciner i slimlaget i tarmbarriæren. FGDS-pasientene skiller ut store mengder klorid- og bikarbonationer samt vann til tarmen, og det kan tenkes at dette svekker mucinlaget, som også er svært pH-avhengig. Hilde Von Volkmann vil nå undersøke FGDS-pasienter og normale kontroller med en relativt ny teknikk, "Smartpill", som er en kapsel som man svelger og som kontinuerlig vil registrere pH, trykk og temperatur gjennom hele mage-tarmkanalen. Før inntak av "Smartpill" og et lite måltid og inntil 4 timer etterpå vil hun også gjøre ultralydundersøkelser, og ta prøver til måling av hormoner som skilles ut i tarmen. Dette vil også gi nye unike data om samspillet mellom væskeutskillelse, tarmmotorikk og hormonutskillelse i tarmen.

Guanylat syklase C aktivering – betydning for utvikling av kronisk diare og inflammasjon i tarmenHovedmålet er å undersøke betydningen av guanylat syklase C signalomforming for utvikling av kronisk diare, spesielt inflammatorisk tarmsykdom, og teste om hemming av signalveien kan ha terapeutisk potensial. Prosjektet omfatter pasienter med en sjelden genfeil i denne signalomformingen, transgene dyr og pasienter med Crohn's sykdom.Prosjektet er basert på vår oppdagelse av en aktiverende genfeil i genet som koder for guanylat syklase C hos medlemmer av en stor familie som har kronisk diare og økt risiko for utvikling av inflammasjon i tarmen (Crohn's sykdom). Deres tilstand, familiært GUCY2C diaresyndrom (FGDS), har mange likhetstrekk med den vanlige tilstanden irritabel tarm syndrom, og de har øket risiko også for tarmslyng. Ved molekylærgenetiske studier av genuttrykk i celler fra tarmen og av tarmfloraen hos disse pasientene vil vi forsøke å identifisere nye markører for inflammasjon i tarmen. Innsamling av avføringsprøver fra pasienter og friske kontrollpersoner i familien er nå avsluttet og analyse av tarmfloraen vil bli utført i løpet av vinteren 2014. Mikromatriseanalyse av genuttrykket i celler fra tynntarmsbiopsier (ileum) til FGDS pasientene pågår nå, og i samme oppsettet analyseres prøver fra pasienter med ulike andre inflammasjonssykdommer i tarmen, noe som gir en ulik mulighet for å kunne sammenligne disse. Modellsystemer gir muligheter for kontrollert manipulering av guanylat syklase C signalomforming og mikrobiomet, og et av hovedmålene for prosjektet er å utvikle en transgen mus som uttrykker den aktiverende genfeilen c.2519G>T. I 2013 etablerte vi samarbeid om dette delprosjektet med professorene Halvor Sommerfeldt og Nina Langeland (UiB, Helse Bergen) og vår indiske samarbeidspartner professor Sandhya S Visweswariah. Dette sikrer at vi har totaløkonomi og personell til å gjennomføre utvikling og karakterisering av dyremodellen når den foreligger høsten 2014. Før kontraktsinngåelse med firmaet Taconic, gjennomførte vi nødvendige forsøk som viser at genfeilen også når den er uttrykt i celler fra mus har en aktiverende effekt på guanylat syklase C. Inflammatorisk tarmsykdom er en av de tilstander som er best undersøkt med tanke på genetiske sårbarhetsvarianter. Vi har undersøkt et tilgjengelig datasett fra en GWAS metaanalyse (6333 pasienter med Crohns sykdom) med tanke på om det finnes andre gener relatert til guanylat syklase C signalveien som er assosiert med øket risiko for å utvikle inflammasjon. Vi laget en kurert liste med 104 gener relatert til signalveien som er uttrykt i siste delen av tynntarmen (ileum), og gjennomførte en såkalt "Gene Set Enrichment Analysis". Denne viste grenseverdi statistisk signifikans for at det er en øket opphopning av sårbarhetsvarianter assosiert med Crohn's sykdom i den aktuelle signalveien. Samarbeidspartner Mauro D’Amato har fått vår kurerte genliste og utfører nå samme type analyse i et svensk materiale med 600 pasienter som har irritabel tarmsyndrom. Bare 1/3 av pasientene med FGDS har utviklet tegn til inflammatorisk tarmsykdom, og vi ønsket å undersøke om disse har opphopning av andre kjente risikovarianter for inflammasjon. En mikromatriseanalyse (Immunochip) som inneholder alle kjente risikovarianter (140) for denne tilstanden ble utført hos 29 pasienter, og resultatene viser at det er en spesiell risikovariant som skiller de som har inflammasjon fra de som ikke har det. Høsten 2013 startet vi i samarbeid med gastroenterologisk seksjon en forskningspoliklinikk for FGDS-pasientene hvor hensikten er å samle data for en mer systematisk kartlegging av deres tilstand, tilby optimal behandling og kunne gjennomføre kontrollert intervensjon med aktuelle medikament eller dietter. Dette blir også en del av PhD prosjektet til Hilde von Volkmann som starter sin prosjektperiode i februar 2014.